案例簡(jiǎn)要解析

CRISPR activation for SCN2A-related neurodevelopmental disorders

背景

SCN2A基因編碼鈉通道Nav1.2，與神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)興奮性密切相關(guān)。SCN2A單倍體不足會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)環(huán)路興奮性異常，引發(fā)自閉癥譜系障礙和癲癇等疾病。傳統(tǒng)基因治療難以精準(zhǔn)上調(diào)剩余野生型等位基因表達(dá)，需要開(kāi)發(fā)新型治療策略。

技術(shù)原理

采用CRISPR激活系統(tǒng)，通過(guò)dCas9-VP64融合蛋白靶向SCN2A基因啟動(dòng)子區(qū)域，利用經(jīng)篩選驗(yàn)證的sgRNA-（位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游81 bp）實(shí)現(xiàn)高特異性結(jié)合，在有效激活基因表達(dá)的同時(shí)最大限度降低脫靶風(fēng)險(xiǎn)。為確保高效遞送與穩(wěn)定表達(dá)，分別構(gòu)建了AAV-DJ-saCas9-VP64和AAV-DJ-sgRNA兩種腺相關(guān)病毒載體，通過(guò)優(yōu)化血清型（AAV-DJ）提升轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和組織特異性，從而在目標(biāo)腦區(qū)實(shí)現(xiàn)協(xié)同、持久的SCN2A轉(zhuǎn)錄激活。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用多層面策略系統(tǒng)評(píng)估基因編輯干預(yù)的效果：首先在體外利用Neuro-2a細(xì)胞系進(jìn)行sgRNA轉(zhuǎn)染并通過(guò)qPCR篩選出敲低效率最高的sgRNA；隨后在體內(nèi)使用SCN2A+/-雜合子小鼠模型，從出生后30天（P30）開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。為實(shí)現(xiàn)高效靶向遞送，分別采用腦內(nèi)立體定位注射將CRISPR組件精準(zhǔn)導(dǎo)入內(nèi)側(cè)前額葉皮層（mPFC），以及通過(guò)靜脈注射系統(tǒng)性給予具有血腦屏障穿透能力的AAV-PHP.eB載體。

干預(yù)效果通過(guò)多層次指標(biāo)綜合評(píng)估包括：mPFC神經(jīng)元的電生理特性、鈣成像記錄的神經(jīng)活動(dòng)動(dòng)態(tài)、焦慮/認(rèn)知等相關(guān)行為學(xué)表現(xiàn)以及目標(biāo)基因表達(dá)水平等分子生物學(xué)檢測(cè)。

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關(guān)鍵步驟

首先進(jìn)行載體構(gòu)建，將催化失活的saCas9與轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域VP64融合形成saCas9-VP64表達(dá)元件，并針對(duì)SCN2A啟動(dòng)子區(qū)域（位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游?81 bp）設(shè)計(jì)并優(yōu)化sgRNA序列（sgRNA-），以確保高特異性結(jié)合并降低脫靶風(fēng)險(xiǎn)。隨后，將saCas9-VP64和sgRNA分別包裝入AAV-DJ血清型腺相關(guān)病毒載體，經(jīng)純化后測(cè)定病毒滴度，確保≥1×1013 GC/mL以滿足高效中樞遞送需求。

在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，對(duì)SCN2A?/?小鼠于P30開(kāi)始實(shí)施立體定位手術(shù)，以100 nL/min的恒定流速緩慢注射病毒混合液至mPFC，避免組織損傷并促進(jìn)局部表達(dá)。

術(shù)后3–4周依次開(kāi)展多模態(tài)功能檢測(cè)：

取腦片進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗記錄，分析動(dòng)作電位（AP）基本特性及鈉電流密度：可評(píng)估SCN2A激活是否在單個(gè)神經(jīng)元水平恢復(fù)了電壓門(mén)控鈉通道的功能，可定量驗(yàn)證基因激活是否在電生理層面實(shí)現(xiàn)功能挽救。

利用雙光子顯微鏡對(duì)mPFC神經(jīng)元進(jìn)行活體鈣成像，采集自發(fā)或誘發(fā)活動(dòng)下的ΔF/F信號(hào)：可在局部神經(jīng)環(huán)路層面觀察神經(jīng)元群體活動(dòng)是否恢復(fù)正常。

同時(shí)結(jié)合社交行為測(cè)試和PTZ誘導(dǎo)癲癇模型，評(píng)估環(huán)路功能恢復(fù)對(duì)整體行為的影響：從整體動(dòng)物行為層面驗(yàn)證干預(yù)的治療意義。

Fig1 青春期小鼠Scn2a單倍體不足的基因修復(fù)

技術(shù)創(chuàng)新點(diǎn)

• 精準(zhǔn)激活：僅靶向剩余野生型等位基因避免基因編輯風(fēng)險(xiǎn)；

• 雙模式遞送：局部腦注射+全身靜脈注射適應(yīng)不同研究需求；

• 跨物種驗(yàn)證：小鼠模型+人源iPSC神經(jīng)元增強(qiáng)臨床相關(guān)性；

• 實(shí)時(shí)檢測(cè)：電生理-鈣成像-行為學(xué)閉環(huán)驗(yàn)證確保功能挽救。

文獻(xiàn)引用

• Tamura, S., Nelson, A.D., Spratt, P.W.E. et al. CRISPR activation for SCN2A-related neurodevelopmental disorders. Nature 646, 983–991 (2025). https://doi.org/10.1038/s41586-025-09522-w

• Nelson, A. D. et al. Physical and functional convergence of the autism risk genes Scn2a and Ank2 in neocortical pyramidal cell dendrites. Neuron 112, 1133–1149 (2024).

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