Split-Intein介導(dǎo)的 split-Cre 重組系統(tǒng)是一種高時(shí)空精度、環(huán)路特異性的基因操作工具，廣泛應(yīng)用于神經(jīng)環(huán)路功能研究。split-Intein 介導(dǎo)的split-Cre重組系統(tǒng)是基于 “蛋白質(zhì)反式剪接” 和 “病毒雙向靶向轉(zhuǎn)導(dǎo)” 的雙重特異性調(diào)控策略，核心目標(biāo)是讓有活性的 Cre 重組酶僅在 PFC（前額葉皮層）投射至 BLA（基底外側(cè)杏仁核）的單向回路神經(jīng)元中表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn) Shank3 基因的回路特異性敲除。

原理

split-Cre 的片段化設(shè)計(jì)、Intein 的蛋白質(zhì)反式剪接功能、AAV 病毒的雙向靶向轉(zhuǎn)導(dǎo)特性，三者協(xié)同確保基因操作的回路特異性。

1. split-Cre 與 Intein 的核心功能

split-Cre（片段化 Cre 重組酶）：Cre 重組酶是介導(dǎo) loxP 位點(diǎn)間 DNA 重組的關(guān)鍵工具，但完整 Cre 僅需表達(dá)即可發(fā)揮作用，無法實(shí)現(xiàn) “區(qū)域/回路限制”。研究將Cre重組酶拆分為N 端片段（CreN）和C端片段（CreC），單獨(dú)表達(dá)的 CreN 或 CreC 均無酶活性，只有二者重新組裝為完整 Cre 時(shí)才能識(shí)別 loxP 位點(diǎn)并介導(dǎo)基因敲除。

Intein（內(nèi)含肽）的反式剪接功能：Intein 是一類可在蛋白質(zhì)水平上自我剪接的氨基酸序列，分為 N 端 Intein（InteinN）和 C 端 Intein（InteinC）。當(dāng) InteinN 與 CreN 融合（CreN-InteinN）、InteinC 與 CreC 融合（InteinC-CreC）時(shí)，InteinN 與 InteinC 可通過自身的 “反式剪接” 特性相互識(shí)別并形成復(fù)合物，同時(shí)將 CreN 與 CreC 通過肽鍵連接組裝為有活性的完整 Cre 重組酶，而 Intein 自身則剪接脫離，不影響Cre的功能（這一過程稱為 “蛋白質(zhì)反式剪接”）。

2. AAV病毒的雙向靶向轉(zhuǎn)導(dǎo)特性

順行 AAV（AAV8-CreN-InteinN）：

AAV8 血清型具有順行轉(zhuǎn)導(dǎo)特性，病毒注射至神經(jīng)元胞體所在腦區(qū)（如 PFC）后僅在注射區(qū)神經(jīng)元胞體內(nèi)表達(dá)目的基因（CreN-InteinN），且表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）僅隨軸突運(yùn)輸至末梢，不會(huì)跨突觸傳遞至下游腦區(qū)，確保 CreN-InteinN 僅存在于 PFC 神經(jīng)元中。

逆行 AAV（AAV retro-InteinC-CreC）：

逆行 AAV 是經(jīng)過改造的 AAV 血清型（如 AAVretro）具有逆行轉(zhuǎn)導(dǎo)特性，病毒注射至神經(jīng)元軸突末梢所在腦區(qū)（如BLA）后，會(huì)被軸突末梢攝取并逆向運(yùn)輸至神經(jīng)元胞體，僅在投射至BLA的神經(jīng)元胞體內(nèi)表達(dá)目的基因（InteinC-CreC），確保InteinC-CreC僅存在于向 BLA 投射的神經(jīng)元中。

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3. 回路特異性實(shí)現(xiàn)邏輯

只有同時(shí)滿足以下兩個(gè)條件的神經(jīng)元，才能組裝出有活性的 Cre 重組酶：

位于 PFC 腦區(qū)（表達(dá) CreN-InteinN，來自順行 AAV8 注射）；向 BLA 腦區(qū)投射（表達(dá) InteinC-CreC，來自逆行 AAVretro 注射）。這兩個(gè)條件的交集恰好是 PFC 投射至 BLA 的單向回路神經(jīng)元。只有這類神經(jīng)元中，CreN-InteinN 與 InteinC-CreC才能通過 Intein 反式剪接組裝為完整 Cre，進(jìn)而介導(dǎo) Shank3 基因敲除；其他腦區(qū)神經(jīng)元（如 PFC 不向 BLA 投射的神經(jīng)元）僅表達(dá)單一Cre片段，無法形成活性Cre從而實(shí)現(xiàn)回路特異性。

split-Intein 介導(dǎo)的 split-Cre 重組系統(tǒng)結(jié)合 AAV 病毒的雙向轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)現(xiàn)回路特異性敲除：①向 PFC 注射順行 AAV8-CreN-InteinN 病毒，使其在 PFC 神經(jīng)元胞體表達(dá) N 端 Cre-Intein 融合蛋白（CreN-InteinN）；②向 BLA 注射逆行 AAV retro-InteinC-CreC 病毒，使其在 BLA 神經(jīng)元軸突末梢表達(dá) C 端 Intein-Cre 融合蛋白（InteinC-CreC）；③僅在 PFC 投射至 BLA 的單向回路神經(jīng)元中，CreN 與 CreC 通過 Intein 介導(dǎo)的重組形成有活性的 Cre 酶，進(jìn)而敲除條件性敲除小鼠（Shank3?????）的 Shank3 基因；同時(shí)，通過 Ai-14 Cre 報(bào)告小鼠的 tdTomato 信號(hào)，驗(yàn)證 Cre 僅在 PFC-BLA 回路中表達(dá)。

優(yōu)勢

傳統(tǒng)全腦 Shank3 敲除會(huì)導(dǎo)致多個(gè)腦區(qū)（如紋狀體、海馬）的基因缺失，難以區(qū)分是哪個(gè)腦區(qū)或回路的突變導(dǎo)致社交障礙；而回路特異性敲除可精準(zhǔn)定位 PFC-BLA 回路，排除其他腦區(qū)/回路的干擾，明確該回路中 Shank3 突變與社交行為的直接因果關(guān)系，提高研究的空間特異性和機(jī)制解析的精準(zhǔn)度。

案例簡析

Fig1 PFC-BLA回路特異性Shank3敲除對神經(jīng)元形態(tài)的影響

回路特異性 Cre 表達(dá)驗(yàn)證：

通過向 Shank3f/f:Ai-14 小鼠的 PFC 注射 AAV8-CreN-InteinN、BLA 注射 AAV retro-InteinC-CreC僅在 PFC-BLA 單向投射神經(jīng)元中檢測到 tdTomato 信號(hào)（Cre 報(bào)告信號(hào)），證實(shí) Cre 僅在目標(biāo)回路中活性實(shí)現(xiàn) Shank3 特異性敲除；

神經(jīng)元形態(tài)異常：

3D 重建分析顯示，ctMUT 小鼠 PFC神經(jīng)元的初級(jí)樹突數(shù)量減少，樹突棘密度增加、長度縮短、頭部尺寸減小，明確回路特異性 Shank3 敲除導(dǎo)致的形態(tài)學(xué)缺陷。

選擇該系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)回路特異性敲除原因

高特異性：相比傳統(tǒng)區(qū)域特異性Cre小鼠（如 PFC-Cre 小鼠，可能在PFC非 BLA 投射神經(jīng)元中也表達(dá)Cre），該系統(tǒng)通過順行+逆行 AAV+Intein剪接的雙重限制，實(shí)現(xiàn)了回路水平的精準(zhǔn)靶向，避免其他腦區(qū)/神經(jīng)元的干擾。

靈活性高：無需構(gòu)建復(fù)雜的轉(zhuǎn)基因小鼠品系，僅通過病毒注射即可快速實(shí)現(xiàn)不同回路的特異性基因操作，適用于多種神經(jīng)回路研究。

可擴(kuò)展性強(qiáng)：除了 Cre 重組酶，該系統(tǒng)還可用于表達(dá)其他功能蛋白（如鈣指示劑 GCaMP7f、光敏感通道 ChR2），實(shí)現(xiàn)回路特異性的神經(jīng)活動(dòng)監(jiān)測或光遺傳學(xué)調(diào)控（如研究中同時(shí)用該系統(tǒng)表達(dá) GCaMP7f 監(jiān)測 PFC-BLA 回路鈣信號(hào)）。

總結(jié)

從分子、細(xì)胞、行為學(xué)層面檢測 Shank3 敲除效果，分子水平通過 RT-PCR 和 Western Blot 驗(yàn)證 PFC-BLA 回路中Shank3 mRNA 與蛋白表達(dá)降低；

細(xì)胞水平借助共聚焦 3D 重建分析神經(jīng)元形態(tài)異常（樹突數(shù)量減少、樹突棘密度增加等）；

通過全細(xì)胞膜片鉗記錄 mEPSC/mIPSC 驗(yàn)證突觸傳遞失衡（興奮性增強(qiáng)、抑制性減弱）；

可結(jié)合行為學(xué)水平例如：利用圓形社交場域（RSA）測試觀察社交缺陷（總嗅探時(shí)間、S 區(qū)停留時(shí)間等指標(biāo)降低）；

注意需要同時(shí)設(shè)置多重對照（單獨(dú)注射病毒組、野生型注射組等）排除干擾。

文獻(xiàn)引用：

• Kim S, Kim YE, Song I, Ujihara Y, Kim N, Jiang YH, Yin HH, Lee TH, Kim IH. Neural circuit pathology driven by Shank3 mutation disrupts social behaviors. Cell Rep. 2022 Jun 7;39(10):110906. doi: 10.1016/j.celrep.2022.110906. PMID: 35675770; PMCID: PMC9210496.

• Bey AL, Wang X, Yan H, Kim N, Passman RL, Yang Y, Cao X, Towers AJ, Hulbert SW, Duffney LJ, et al. (2018). Brain region-specific disruption of Shank3 in mice reveals a dissociation for cortical and striatal circuits in autism-related behaviors. Transl. Psychiatry 8, 94. 10.1038/s41398-018-0142-6.

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