歡迎關(guān)注類器官前言（沿）進(jìn)展，第一時(shí)間了解類器官領(lǐng)域（生物學(xué)、癌癥生物學(xué)、人工智能、材料學(xué)、仿生學(xué)）的新進(jìn)展；同時(shí)跟進(jìn)國(guó)際國(guó)內(nèi)相關(guān)行業(yè)的發(fā)展信息導(dǎo)語(yǔ)：新生豬氣道“類原位”模型 AirTECH：重建隱匿的氣道腺體功能，為囊性纖維化研究打開(kāi)關(guān)鍵窗口

在 Science Advances（2025 年 11 月）的一篇研究論文中，美國(guó)愛(ài)荷華大學(xué)（University of Iowa）的 Kaleb C. Bierstedt、Meng-Hsuan Lin 和 Yuliang Xie 團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了一套名為 AirTECH 的氣道組織培養(yǎng)體系。該體系利用新生豬氣道外植體，在一個(gè)控制精確的水凝膠–空氣界面下持續(xù)培養(yǎng) 14 天以上，使氣道表面上皮、纖毛、平滑肌以及最難長(zhǎng)期維持的氣道腺體（submucosal glands，SMGs）保持完整的組織結(jié)構(gòu)與功能狀態(tài)。借助這一系統(tǒng)，研究團(tuán)隊(duì)得以首次在體外穩(wěn)定觀察 CF（囊性纖維化）早期的腺體病理反應(yīng)，并進(jìn)一步探索氣道基因治療的組織靶向性問(wèn)題，為呼吸道疾病模型帶來(lái)重要突破。

2｜研究新穎性

AirTECH 的出現(xiàn)，為氣道生物學(xué)長(zhǎng)期面臨的一個(gè)核心難題提供了解決思路。長(zhǎng)期以來(lái)，研究者一直希望能夠在體外保留結(jié)構(gòu)完整的氣道腺體，但各種傳統(tǒng)系統(tǒng)——包括浸沒(méi)培養(yǎng)、氣道切片、類器官、球體培養(yǎng)甚至 lung-on-chip 技術(shù)——都無(wú)法重建腺體多細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及其與周圍上皮、肌層的整合狀態(tài)。AirTECH 之所以具有獨(dú)特價(jià)值，正是因?yàn)樗茉谒z–空氣界面的環(huán)境中保持腺體的原生組織形態(tài)，并同時(shí)維護(hù)黏液纖毛清除、黏液分泌以及平滑肌收縮等多種整合性功能。更重要的是，該體系讓“早期 CF 氣道腺體變化”這一在動(dòng)物模型中極難捕捉的階段，第一次能夠被穩(wěn)定、可控地再現(xiàn)。過(guò)去的基因治療研究受限于動(dòng)物中腺體與表面上皮同時(shí)受轉(zhuǎn)導(dǎo)的現(xiàn)象，使研究者始終無(wú)法區(qū)分不同細(xì)胞類型的貢獻(xiàn)，而 AirTECH 則以其“表面上皮選擇性轉(zhuǎn)導(dǎo)”的特性，為細(xì)分基因治療靶向性與細(xì)胞作用機(jī)制提供新工具。

3｜科學(xué)背景與研究現(xiàn)狀

氣道 submucosal glands（SMGs）是黏液系統(tǒng)的核心組成部分，它們分泌大量黏液、抗菌肽，并在大顆粒物清除和氣道再生中發(fā)揮重要作用。盡管其功能重要，但由于它們位于上皮層之下、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，因此在體外難以維持，導(dǎo)致關(guān)于腺體本身的研究極為有限。囊性纖維化（CF）是一類典型的腺體相關(guān)疾病，CFTR 功能缺失所引起的離子運(yùn)輸障礙會(huì)使腺體分泌的黏液更黏稠、更酸性，進(jìn)一步導(dǎo)致腺體腔隙阻塞、纖毛清除困難與細(xì)菌殺滅能力下降。在新生 CF 豬模型中，這些病變很早、甚至在出生后不久便迅速累積，使研究者難以分離“疾病早期變化”與“感染、炎癥等繼發(fā)因素”。因此，一個(gè)能夠維持新生時(shí)期組織狀態(tài)、同時(shí)排除外界病理因素干擾的體外體系，一直是 CF 發(fā)病研究的重大缺口。

與此同時(shí)，氣道基因治療的進(jìn)展促使研究者必須更精確地理解不同細(xì)胞層在疾病與治療中的作用。表面上皮與腺體均表達(dá) CFTR，但在動(dòng)物體內(nèi)，病毒載體通常會(huì)同時(shí)感染兩者，阻礙了對(duì)“哪層組織更關(guān)鍵”的判斷。因此，一個(gè)能夠選擇性實(shí)現(xiàn)表面上皮而不觸及腺體的轉(zhuǎn)導(dǎo)體系，對(duì)于未來(lái)的基因治療策略具有重要意義。AirTECH 的出現(xiàn)正是從這些迫切需求中生長(zhǎng)出來(lái)的。

4｜技術(shù)路線

（1）外植體構(gòu)建流程
AirTECH 的建立首先依賴新生豬氣管的獲取與處理。研究團(tuán)隊(duì)將氣管沿腹側(cè)切開(kāi)后，以 6 mm 打孔工具取得若干外植體，使每個(gè)組織塊都包含上皮、腺體和周圍結(jié)構(gòu)。這樣的尺寸既保持組織完整性，又利于在培養(yǎng)體系中實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的物理支撐與營(yíng)養(yǎng)交換。

（2）水凝膠–空氣界面的設(shè)計(jì)原理
每個(gè)外植體被安置在填充了 25% Matrigel 的 Transwell 插槽中，使基底側(cè)完全嵌入水凝膠，而頂端則暴露于空氣。這樣的結(jié)構(gòu)既提供類似 ECM 的三維黏附與支架信號(hào)，又讓上皮暴露于空氣，從而維持黏液與纖毛功能，這點(diǎn)是傳統(tǒng)浸沒(méi)培養(yǎng)無(wú)法實(shí)現(xiàn)的。

（3）并行化與穩(wěn)定性
AirTECH 使用標(biāo)準(zhǔn) 12-well Transwell，允許多個(gè)樣本并行培養(yǎng)，便于對(duì)照試驗(yàn)和時(shí)間序列實(shí)驗(yàn)。組織在 5% CO?、高濕度、37°C 的孵育條件下穩(wěn)定維持，其結(jié)構(gòu)在兩周內(nèi)保持接近原位狀態(tài)，成為后續(xù)刺激實(shí)驗(yàn)與功能測(cè)試的基礎(chǔ)。

5｜實(shí)驗(yàn)方法

（1）組織學(xué)與結(jié)構(gòu)完整性評(píng)估
研究團(tuán)隊(duì)通過(guò) H&E、PAS 與多標(biāo)記免疫熒光全面分析 AirTECH 中腺體、上皮、基底細(xì)胞、纖毛細(xì)胞及軟骨層的保存情況。這些染色證明，即便經(jīng)過(guò) 14 天培養(yǎng)，組織結(jié)構(gòu)仍與新鮮組織高度一致，為 AirTECH 的穩(wěn)定性提供最核心的證據(jù)。

（2）轉(zhuǎn)錄組分析的使用
通過(guò) bulk RNA-seq，作者比較了 AirTECH 與新鮮組織之間的基因表達(dá)差異。該實(shí)驗(yàn)關(guān)注上皮細(xì)胞、腺體細(xì)胞與離子通道的特征基因是否在體外環(huán)境中保持穩(wěn)定，從而驗(yàn)證 AirTECH 是否改變了氣道系統(tǒng)的分子層特征。

（3）黏液纖毛清除功能的檢測(cè)
黏液纖毛清除實(shí)驗(yàn)結(jié)合了熒光納米粒標(biāo)記、甲酰膽堿刺激與時(shí)間平均的全景成像。研究者觀察黏液 strands 的形成、斷裂與運(yùn)輸軌跡，以評(píng)估纖毛與腺體協(xié)同的清除功能，并進(jìn)一步分析離子運(yùn)輸變化（如 bumetanide）對(duì)黏液動(dòng)力學(xué)的影響。

（4）炎癥刺激實(shí)驗(yàn)的設(shè)置
為了模擬 CF 氣道對(duì)外界細(xì)菌成分的反應(yīng)，研究人員將 LPS 加入 AirTECH 的上皮與基底兩側(cè)，持續(xù)刺激 7 天，在無(wú)感染與無(wú)炎癥背景下直接評(píng)估 LPS 對(duì)新生 CF 氣道腺體的影響。

（5）腺病毒基因轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)
腺病毒 Ad5-CMV-eGFP 被用來(lái)觀察不同細(xì)胞層的易感性。在 AirTECH 中，病毒能有效感染表面上皮，但很難進(jìn)入腺體。研究者借此探討“層級(jí)選擇性”，這一特性在動(dòng)物中因病毒擴(kuò)散路徑復(fù)雜而無(wú)法明確區(qū)分。

6｜按圖表順序的結(jié)果解析

（1）圖 1：AirTECH 模型的建立與組織形態(tài)保留
圖 1 顯示培養(yǎng)體系的完整結(jié)構(gòu)。14 天后組織仍保持原始的溝槽狀表面，并有細(xì)胞向水凝膠基底方向延展，表明組織與水凝膠之間形成穩(wěn)定的結(jié)合。這種結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性是維持腺體和上皮功能的前提，也為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

（2）圖 2：腺體與上皮結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)期維持
通過(guò) H&E 與 PAS 染色，作者展示了腺體腺泡、導(dǎo)管、杯狀細(xì)胞與纖毛上皮在 AirTECH 中均被完整保存。免疫染色進(jìn)一步確認(rèn)了 MUC5B 主導(dǎo)的腺體黏液細(xì)胞、PLUNC 陽(yáng)性的漿液細(xì)胞、KRT5 陽(yáng)性的肌上皮細(xì)胞等完整存在。這些結(jié)果說(shuō)明 AirTECH 不僅保留了表面上皮，連深層腺體系統(tǒng)也得到持續(xù)維持。

（3）圖 3：基因表達(dá)譜與新鮮組織高度一致
RNA-seq 顯示超過(guò) 97% 的基因表達(dá)保持穩(wěn)定。少數(shù)差異與代謝、ECM 相互作用和無(wú)血管狀態(tài)相關(guān)，但上皮與腺體的標(biāo)志基因幾乎完全保持不變。這說(shuō)明在結(jié)構(gòu)維持的前提下，AirTECH 同樣能維持分子層的“原位特征”。

（4）圖 4：黏液纖毛清除功能的再現(xiàn)
在甲酰膽堿刺激下，氣道組織迅速分泌黏液 strands，這些 strands 在正常 HCO??/Cl? 環(huán)境中逐漸斷裂并被纖毛清除。而在使用 bumetanide 的條件下，黏液 strands 難以斷裂并大量殘留。AirTECH 因此成功模擬了 CF 風(fēng)格的黏液動(dòng)力學(xué)變化，為體外重現(xiàn)黏液物性提供了罕見(jiàn)的窗口。

（5）圖 5：新生 CF 氣道對(duì) LPS 的特異性反應(yīng)
在無(wú)感染背景下，AirTECH 能保持新生 CF 氣道的健康狀態(tài)，而 LPS 刺激后 CF 組織表現(xiàn)出明顯的 MUC5AC 增強(qiáng)，無(wú)論在表面上皮還是腺體中都如此；相比之下，WT 組織則沒(méi)有同樣的反應(yīng)。這直接證明 CF 氣道對(duì)外界刺激更敏感，并呈現(xiàn)典型的黏液改變模式。

（6）圖 6：基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞層選擇性
腺病毒在 AirTECH 中僅感染表面上皮，而不進(jìn)入腺體。配合 WGA 擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)，研究者確認(rèn)腺體與上皮之間存在明確的物理屏障，使病毒難以抵達(dá)腺體部位。AirTECH 因此成為分層解析基因治療靶向性的理想平臺(tái)。

7｜討論

1）AirTECH 為氣道生物學(xué)提供了前所未有的穩(wěn)定窗口
AirTECH 的價(jià)值首先體現(xiàn)在其對(duì)氣道多層結(jié)構(gòu)的完整重建能力。傳統(tǒng)體外模型只能捕捉表面上皮的狀態(tài)，而腺體這一深層結(jié)構(gòu)由于對(duì) ECM、氧氣、機(jī)械環(huán)境等多重條件的依賴，幾乎無(wú)法維持。AirTECH 同時(shí)保持上皮、腺體、平滑肌和軟骨的完整性，使研究者能夠觀察這些結(jié)構(gòu)在統(tǒng)一體系下的協(xié)同功能。由于腺體在黏液分泌、纖毛清除和氣道再生中扮演關(guān)鍵角色，AirTECH 的出現(xiàn)使許多長(zhǎng)期難以回答的問(wèn)題得到推進(jìn)。

（2）為囊性纖維化的“早期病程”提供真實(shí)體外場(chǎng)景
在囊性纖維化動(dòng)物模型中，出生后的感染、炎癥和組織重塑過(guò)程迅速推進(jìn)，使研究者難以觀察最初的腺體反應(yīng)，也不可能將外界刺激的影響與繼發(fā)因素區(qū)分開(kāi)來(lái)。AirTECH 通過(guò)維持組織的“新生狀態(tài)”，成功剝離了這些干擾，讓 LPS 等單一因素的作用能夠直接呈現(xiàn)。正是由于這種環(huán)境的純凈性，研究團(tuán)隊(duì)得以在第 5 圖中看到 CF 氣道對(duì) LPS 的異常敏感，并明確這種差異來(lái)自腺體與上皮本身，而非炎癥導(dǎo)致的次級(jí)改變。

（3）為氣道基因治療提供細(xì)胞層級(jí)的作用路徑
在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，病毒載體容易同時(shí)感染表面上皮和腺體，導(dǎo)致不同細(xì)胞層的貢獻(xiàn)難以區(qū)分。AirTECH 中病毒只進(jìn)入表面上皮，而腺體幾乎完全不受影響，這種天然的選擇性為未來(lái)“層級(jí)功能解析”提供了重要可能。例如研究者可以在 CF 氣道中僅恢復(fù)上皮 CFTR，然后觀察腺體功能是否因此改善，從而更精確判斷不同細(xì)胞層在病理中的作用。

（4）AirTECH 兼具類原位的真實(shí)性與體外體系的可控性
研究者能夠通過(guò)單一因素刺激、基因轉(zhuǎn)導(dǎo)、離子通道抑制以及多層組織成像等方式，在一個(gè)完全可控的環(huán)境中逐步剖析復(fù)雜氣道功能。相比動(dòng)物模型，AirTECH 在成本、重復(fù)性、并行性和實(shí)驗(yàn)變量控制方面均具有優(yōu)勢(shì)，使其不僅適用于基礎(chǔ)研究，也有望在藥物篩選和治療策略評(píng)估中發(fā)揮作用。

8｜研究局限性

（1）無(wú)血管體系帶來(lái)的代謝與擴(kuò)散限制
AirTECH 在維持組織結(jié)構(gòu)的同時(shí)，也不可避免地呈現(xiàn)出無(wú)血管的特性。氧氣和營(yíng)養(yǎng)完全依賴擴(kuò)散，而廢物同樣以緩慢方式排出，這使得深層組織的代謝環(huán)境與體內(nèi)存在差異。轉(zhuǎn)錄組結(jié)果中與代謝和應(yīng)激相關(guān)的通路變化，可能正是這種擴(kuò)散限制導(dǎo)致的。因此，AirTECH 在模擬復(fù)雜代謝網(wǎng)絡(luò)時(shí)仍存在一定偏差。

（2）Matrigel 與天然 ECM 仍存在較大差別
Matrigel 作為支撐材料雖能提供結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，但其成分復(fù)雜且?guī)в袆?dòng)物來(lái)源的批次差異。對(duì) ECM 依賴性強(qiáng)的細(xì)胞類型，如肌上皮細(xì)胞或漿液細(xì)胞，可能會(huì)因此呈現(xiàn)與體內(nèi)不同的行為模式。未來(lái)若能替換為成分可定義的合成水凝膠或脫細(xì)胞基質(zhì)，有望進(jìn)一步提升模型生理相關(guān)性。

（3）缺乏機(jī)械刺激對(duì)黏液與離子通道調(diào)控造成限制
真實(shí)氣道在呼吸過(guò)程中承受周期性牽張、剪切力和氣流沖擊，這些機(jī)械刺激與黏液分泌、纖毛運(yùn)動(dòng)甚至離子通道開(kāi)放狀態(tài)密切相關(guān)。AirTECH 屬于靜態(tài)體系，無(wú)法準(zhǔn)確模擬呼吸過(guò)程的物理環(huán)境，因此在研究與機(jī)械力相關(guān)的氣道功能時(shí)存在明顯不足。

（4）未納入人體組織，轉(zhuǎn)化意義仍需進(jìn)一步驗(yàn)證
雖然豬模型在解剖結(jié)構(gòu)和腺體分布方面接近人類，但臨床相關(guān)性仍受物種差異制約。未來(lái)若能從手術(shù)或移植來(lái)源的氣道組織中建立人類版本的 AirTECH，將更有助于理解人類疾病的獨(dú)特機(jī)制，并推動(dòng)藥物與基因治療策略的轉(zhuǎn)化。

（5）目前的研究主要集中在 14 天周期內(nèi)，長(zhǎng)期培養(yǎng)仍待探索
AirTECH 在兩周內(nèi)表現(xiàn)穩(wěn)定，但更長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)可能會(huì)暴露新的結(jié)構(gòu)或功能變化。例如腺體分泌模式是否改變、上皮更新是否出現(xiàn)偏移、平滑肌是否發(fā)生反應(yīng)性重塑等，都需要未來(lái)的長(zhǎng)期研究來(lái)驗(yàn)證。這些問(wèn)題的答案將決定 AirTECH 是否適合模擬慢性疾病模型。

參考文獻(xiàn)：Bierstedt K.C., Lin M.-H., Yu W., et al.Porcine airway tissue explant culture at a hydrogel-air interface to model submucosal glands in cystic fibrosis progression and therapy. Science Advances, 2025, 11: eady4866.

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