第一作者：黃蓉、蔡創(chuàng)

通訊作者：秦四勇

通訊單位：中南民族大學(xué)

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天然骨骼肌的顯著特征在于其高度分層的微結(jié)構(gòu)與有序排列的肌纖維。針對(duì)體積性肌肉損失（VML）的治療，研發(fā)能夠復(fù)制天然肌肉環(huán)境分層排列微觀結(jié)構(gòu)的組織支架，既充滿希望又面臨挑戰(zhàn)。此外，理想的支架應(yīng)具備可調(diào)節(jié)的成分，以實(shí)現(xiàn)特定的功能調(diào)控。

近期，中南民族大學(xué)秦四勇教授團(tuán)隊(duì)創(chuàng)新性地制備了一種可注射的自組裝肽液晶（LC）水凝膠，其具有分層纖維排列結(jié)構(gòu)，可有效支持骨骼肌再生。為模擬骨骼肌的物理化學(xué)功能，將二維碳化鈦納米片Ti3C2Tx MXene作為外源成分引入LC水凝膠，顯著增強(qiáng)了水凝膠的機(jī)械強(qiáng)度、抗炎活性和電導(dǎo)率。所得的Ti3C2Tx/LC水凝膠能夠有效引導(dǎo)成肌細(xì)胞有序排列，促進(jìn)成肌分化與血管生成。與無(wú)序排列的非液晶（NLC）水凝膠相比，具有分層結(jié)構(gòu)的排列Ti3C2Tx/LC水凝膠在大鼠VML模型中，能夠顯著促進(jìn)新肌肉組織的形成，并推動(dòng)肌肉功能恢復(fù)。本研究為制備有序排列的水凝膠支架提供了一種高效且實(shí)用的策略，在肌肉組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。文章第一作者是中南民族大學(xué)黃蓉副教授和碩士研究生蔡創(chuàng)。該研究得到國(guó)家自然科學(xué)基金（52273313，22377152）、武漢知識(shí)創(chuàng)新計(jì)劃-基礎(chǔ)研究（2023020201010150）、中南民族大學(xué)中央大學(xué)基本科研基金（CZQ24008）、湖北省能源高分子材料工程技術(shù)研究中心平臺(tái)項(xiàng)目（PTZ24012）的資助。

圖 1、引導(dǎo)肌細(xì)胞排列、促進(jìn)肌肉再生和功能恢復(fù)的定向肽液晶水凝膠支架構(gòu)建示意圖

【研究背景】

體積性肌肉損失（VML）多由嚴(yán)重創(chuàng)傷、車禍、腫瘤切除等病理狀況引發(fā)，當(dāng)損傷超出身體再生能力時(shí)，會(huì)導(dǎo)致肌肉萎縮，損害運(yùn)動(dòng)功能并降低生活質(zhì)量。臨床常用自體肌肉移植治療，但受供體肌肉稀缺、宿主排斥反應(yīng)及再生效率低等限制。肌肉組織工程通過(guò)生物材料支架提供結(jié)構(gòu)支持，展現(xiàn)出治療潛力，但需模擬天然肌肉組織的分層排列纖維結(jié)構(gòu)以引導(dǎo)細(xì)胞定向再生?，F(xiàn)有VML支架制造技術(shù)（如3D打印、靜電紡絲等）因工藝復(fù)雜、成本高、設(shè)備專用性強(qiáng)且無(wú)法復(fù)制天然肌肉的單向分層微環(huán)境，實(shí)際應(yīng)用受限。此外，預(yù)制支架在細(xì)胞包裹、成分調(diào)節(jié)及適應(yīng)不規(guī)則缺損形狀方面存在不足，亟需開發(fā)兼具可注射性、分層排列結(jié)構(gòu)及成分可調(diào)性的新型支架。肽類材料憑借生物相容性、結(jié)構(gòu)可設(shè)計(jì)性、自組裝特性及刺激響應(yīng)性，成為構(gòu)建理想支架的候選。其可注射水凝膠特性能填充不規(guī)則缺損，通過(guò)分子設(shè)計(jì)可形成分層排列的肽液晶納米纖維結(jié)構(gòu)。本研究旨在設(shè)計(jì)自組裝肽，構(gòu)建具有層次比對(duì)的水凝膠支架，以實(shí)現(xiàn)VML修復(fù)與肌肉功能恢復(fù)。

【圖文導(dǎo)讀】

1.Ti3C2Tx/LC 水凝膠的建立與表征

仿生 LC水凝膠支架，通過(guò)分子自組裝模擬天然骨骼肌的微環(huán)境特征?；贑15H31-CONH-VE-CONH2短肽的熱響應(yīng)自組裝，構(gòu)建了具有pH依賴性雙折射特性的LC水凝膠：在pH 7.4時(shí)形成定向排列的纖維結(jié)構(gòu)（LC水凝膠），而在pH 6.8時(shí)呈現(xiàn)隨機(jī)取向（NLC水凝膠）。掃描電鏡（SEM）和掃描透射電鏡（STEM）證實(shí)，LC水凝膠的纖維呈分級(jí)排列，形成包含多級(jí)纖維束的微觀結(jié)構(gòu)；流變學(xué)分析顯示其具備類固體行為（儲(chǔ)能模量G′＞損耗模量G″）。這種結(jié)構(gòu)差異被歸因于谷氨酸殘基的質(zhì)子化狀態(tài)變化，pH 7.4時(shí)去質(zhì)子化增強(qiáng)靜電排斥，促進(jìn)納米纖維的有序排列。

為賦予支架多功能性，研究引入Ti3C2Tx-MXene納米材料，構(gòu)建了Ti3C2Tx/LC雜化水凝膠。摻入后，水凝膠保持各向異性特征（偏光顯微鏡和激光散射驗(yàn)證），同時(shí)機(jī)械剛度顯著提升（G′值增加），電導(dǎo)率隨MXene濃度梯度增強(qiáng)?？勺⑸湫詫?shí)驗(yàn)表明，LC水凝膠具備溫度敏感和剪切稀化特性，注射后仍穩(wěn)定保留雙折射結(jié)構(gòu)。功能上，Ti3C2Tx/LC水凝膠通過(guò)清除DPPH自由基（效率提升10倍）和降低細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS），有效緩解氧化應(yīng)激；同時(shí)顯著下調(diào)炎癥因子（TNF-α、IL-4等）的mRNA表達(dá)，可為成肌細(xì)胞增殖和肌源性分化提供支持性微環(huán)境，促進(jìn)VML缺損的功能再生。

圖2.LC、NLC、Ti3C2Tx/NLC和Ti3C2Tx/LC水凝膠的表征。(A)水凝膠的構(gòu)建示意圖。（B， C） LC和NLC水凝膠與Ti3C2Tx MXene混合前后的照片和POM圖像。（D， E）自組裝肽納米纖維SEM圖像和取向分布統(tǒng)計(jì)分析。(F)添加Ti3C2Tx MXene前后LC和NLC水凝膠的儲(chǔ)存模量G’和損耗模量G”。（G-I）不同水凝膠的激光散射圖像、電導(dǎo)率和自由基清除能力分析。

2.Ti3C2Tx /LC 水凝膠對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用及其調(diào)控機(jī)制

本研究系統(tǒng)驗(yàn)證了Ti3C2Tx/LC水凝膠的生物相容性及促細(xì)胞增殖能力。溶血實(shí)驗(yàn)和活/死細(xì)胞染色證實(shí)兩種水凝膠均具備高生物相容性。CCK-8測(cè)定表明Ti3C2Tx/LC水凝膠中C2C12細(xì)胞7天后存活率顯著高于Ti3C2Tx/NLC組，EdU摻入實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)LC水凝膠具備更強(qiáng)的促細(xì)胞增殖能力。轉(zhuǎn)錄組分析揭示差異表達(dá)基因（DEGs）主要富集于細(xì)胞周期、PI3K-Akt及MAPK信號(hào)通路，其中Ptx3基因上調(diào)與增殖正相關(guān)，Angpt1基因下調(diào)促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖。蛋白質(zhì)印跡證實(shí)LC水凝膠通過(guò)上調(diào)PCNA及磷酸化Akt、p38 MAPK、JNK、ERK1/2等關(guān)鍵信號(hào)分子表達(dá)，增強(qiáng)PI3K/Akt和MAPK通路活性。研究證明各向異性Ti3C2Tx/LC水凝膠可通過(guò)調(diào)控關(guān)鍵信號(hào)通路協(xié)調(diào)細(xì)胞生長(zhǎng)，展現(xiàn)作為仿生支架的優(yōu)異潛力。

圖3.Ti3C2Tx/LC水凝膠促進(jìn)成肌細(xì)胞C2C12增殖的機(jī)制。(A)溶血率分析。(B) Ti3C2Tx/NLC和Ti3C2Tx/LC水凝膠對(duì)細(xì)胞活力的影響。(C) C2C12細(xì)胞在Ti3C2Tx/NLC和Ti3C2Tx/LC水凝膠支架中預(yù)培養(yǎng)72 h后的EdU染色。(D)基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的KEGG通路富集分析。(E)細(xì)胞增殖相關(guān)差異表達(dá)基因熱圖。(F) mRNA表達(dá)水平定量分析。(G) PCNA、Paxillin、p-AKT、p-Erk1/2、p-p38 MAPK、p-JNK蛋白的Western blot圖。(H)免疫印跡數(shù)據(jù)定量分析。

3.Ti3C2Tx /LC 水凝膠對(duì)細(xì)胞定向排列和遷移的促進(jìn)作用

Ti3C2Tx/LC水凝膠通過(guò)模擬天然骨骼肌的分層排列結(jié)構(gòu)，有效引導(dǎo)細(xì)胞定向生長(zhǎng)與遷移。實(shí)驗(yàn)表明，在LC水凝膠表面培養(yǎng)的C2C12成肌細(xì)胞、HUVEC內(nèi)皮細(xì)胞和3T3成纖維細(xì)胞均呈現(xiàn)細(xì)長(zhǎng)形態(tài)及顯著定向排列（取向角集中于20°范圍內(nèi)），而NLC水凝膠和2D對(duì)照組細(xì)胞呈隨機(jī)分布；純LC水凝膠（無(wú)Ti3C2Tx）同樣證實(shí)結(jié)構(gòu)本身是接觸引導(dǎo)的關(guān)鍵因素。定量分析顯示LC水凝膠組細(xì)胞擴(kuò)散面積更大、縱橫比更高，且12小時(shí)內(nèi)完成動(dòng)態(tài)排列過(guò)程。遷移實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步揭示，預(yù)培養(yǎng)于LC水凝膠的細(xì)胞，其2D劃痕于36小時(shí)完全閉合，且3D transwell遷移細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組提升明顯。研究證明該肽液晶水凝膠的分級(jí)纖維排列作為地形線索，可主動(dòng)調(diào)控細(xì)胞行為，為肌肉組織再生提供仿生微環(huán)境支持。

圖4.Ti3C2Tx/LC水凝膠對(duì)細(xì)胞排列和遷移的調(diào)控作用。(A) C2C12、HUVEC和3T3細(xì)胞在二維表面、Ti3C2Tx/NLC水凝膠、Ti3C2Tx/LC水凝膠中培養(yǎng)后的共聚焦圖像，并對(duì)細(xì)胞方向分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。C2C12細(xì)胞取向在(B) -20°—20°范圍內(nèi)，(C)細(xì)胞鋪展面積，(D)細(xì)胞長(zhǎng)寬比的比例。(E) C2C12細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖像和(F)定量分析。(G) C2C12細(xì)胞Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖像和(H)定量分析。

4.Ti3C2Tx /LC 水凝膠支架誘導(dǎo)成肌分化、ECM構(gòu)建和血管生成

Ti3C2Tx/LC水凝膠對(duì)肌肉再生關(guān)鍵過(guò)程起調(diào)控作用。Western印跡分析顯示，與2D培養(yǎng)組及NLC水凝膠組相比，LC水凝膠組中C2C12細(xì)胞的肌球蛋白重鏈（MHC）蛋白，3T3細(xì)胞的I型膠原（ECM關(guān)鍵成分）和波形蛋白（細(xì)胞骨架標(biāo)志物），HUVEC的血管標(biāo)志物CD31（促進(jìn)血管腔形成）和eNOS（調(diào)節(jié)血管舒張）均顯著上調(diào)。RT-qPCR進(jìn)一步證實(shí)，LC水凝膠組MHC和增殖標(biāo)志物PCNA的mRNA含量最高，而肌肉生長(zhǎng)抑制素（負(fù)調(diào)控肌生長(zhǎng)）水平最低。功能上，鬼筆環(huán)肽染色顯示LC水凝膠促進(jìn)更密集的F-actin細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)形成，增強(qiáng)細(xì)胞附著與遷移能力；HUVEC血管生成實(shí)驗(yàn)中，LC水凝膠組管數(shù)、連接點(diǎn)、網(wǎng)格面積及血管長(zhǎng)度等指標(biāo)顯著優(yōu)于NLC組。肌管形成實(shí)驗(yàn)表明，LC水凝膠支架引導(dǎo)C2C12細(xì)胞融合為對(duì)齊的多核長(zhǎng)條肌管，融合指數(shù)達(dá)17%，顯著高于2D及NLC組的隨機(jī)取向肌管。綜上，Ti3C2Tx/LC水凝膠通過(guò)協(xié)同調(diào)控肌源性分化、ECM重塑、血管生成及細(xì)胞骨架組織，為肌肉組織協(xié)調(diào)再生提供了獨(dú)特的仿生微環(huán)境。

圖5. Ti3C2Tx/LC水凝膠對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)建、血管生成和成肌分化的誘導(dǎo)作用。(A-B) C2C12細(xì)胞內(nèi)MHC、3T3細(xì)胞內(nèi)I型膠原和vimentin、HUVEC細(xì)胞內(nèi)CD31和eNOS蛋白的 Western blotting圖像和相對(duì)蛋白表達(dá)水平分析。(C) C2C12細(xì)胞中myostatin、PCNA、MHC mRNA的 RT-qPCR定量分析。(D) C2C12細(xì)胞在水凝膠上預(yù)培養(yǎng)三天的細(xì)胞骨架形態(tài)染色圖。(E) HUVEC細(xì)胞在水凝膠上預(yù)培養(yǎng)一天的血管生成圖像和(F)定量分析（管、節(jié)點(diǎn)、網(wǎng)數(shù)、總網(wǎng)面積）。(G)培養(yǎng)七天后水凝膠支架內(nèi)形成肌管的二維和三維免疫熒光圖像及取向分布。 (H)肌管數(shù)，(I)長(zhǎng)度，(J)肌管融合指數(shù)的定量分析。

5.Ti3C2Tx /LC 水凝膠對(duì)肌肉組織和功能的修復(fù)作用

構(gòu)建大鼠脛骨前?。═A）VML模型。14天組織學(xué)分析和免疫熒光顯示，與未處理VML模型組及Ti3C2Tx/NLC組相比，Ti3C2Tx/LC水凝膠組顯著促進(jìn)肌肉再生（新纖維直徑/數(shù)量增加）和血管生成（CD31標(biāo)記密集），同時(shí)膠原蛋白沉積最少，肌球蛋白表達(dá)更接近健康組織水平，組織再生更有序。此外，內(nèi)臟器官及體重監(jiān)測(cè)證實(shí)了該支架的生物相容性。

隨后通過(guò)礦場(chǎng)試驗(yàn)和肌電圖實(shí)驗(yàn)，評(píng)估了各向異性Ti3C2Tx/LC水凝膠支架對(duì)大鼠脛骨前肌的功能恢復(fù)效果。與未處理的VML模型組及Ti3C2Tx/NLC水凝膠組相比，Ti3C2Tx/LC水凝膠組大鼠的行進(jìn)距離顯著增加，活動(dòng)范圍擴(kuò)展至整個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)，并頻繁探索中心區(qū)域。第28天，Ti3C2Tx/LC水凝膠組經(jīng)電刺激后的骨骼肌張力明顯高于其他兩組。以上結(jié)果表明，具有對(duì)齊和分級(jí)微觀結(jié)構(gòu)的Ti3C2Tx/LC水凝膠支架通過(guò)模擬天然骨骼肌的拓?fù)涮卣?，有效促進(jìn)了骨骼肌的組織再生及運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。

圖6. Ti3C2Tx/LC水凝膠支架植入大鼠體積性肌肉損失模型后對(duì)骨骼肌組織的修復(fù)。(A)大鼠體積性肌肉損失圖像。(B) Ti3C2Tx/LC水凝膠介導(dǎo)的體積性肌肉損失修復(fù)示意圖。(C)第14天 H&E染色圖。(D) VML周圍肌纖維直徑。(E)有核肌纖維數(shù)目（新肌纖維）。(F)第14天再生肌肉的Masson染色圖。(G)再生肌肉中膠原蛋白覆蓋率分析。(H)組織切片中肌球蛋白重鏈（MHC，紅色）、CD31（綠色）和細(xì)胞核（DAPI）的免疫熒光染色。(1)缺陷區(qū)域附近的毛細(xì)管面積。

圖7. Ti3C2Tx/LC水凝膠支架植入大鼠體積性肌肉損失模型后對(duì)骨骼肌功能的恢復(fù)。(A)礦場(chǎng)實(shí)驗(yàn)示意圖。(B) 第14天實(shí)驗(yàn)大鼠的代表性運(yùn)動(dòng)軌跡和(C)總運(yùn)動(dòng)距離。(D)肌電圖實(shí)驗(yàn)示意圖。(E) 第28天各組代表性肌電圖。(F) 第28天再生肌肉組織的收縮能力。

【總結(jié)與展望】

這項(xiàng)研究開發(fā)了一種結(jié)合地形和生化線索的可注射肽LC水凝膠支架，有效地填補(bǔ)肌肉缺陷，引導(dǎo)細(xì)胞排列，并促進(jìn)肌肉再生。通過(guò)分子自組裝和熱誘導(dǎo)排列，不需要持續(xù)的外部刺激或引導(dǎo)系統(tǒng)，構(gòu)建了一個(gè)復(fù)制天然骨骼肌細(xì)胞骨架的分層結(jié)構(gòu)、定向排列的肽水凝膠支架。通過(guò)加入Ti3C2Tx MXene，其生物活性進(jìn)一步增強(qiáng)，可產(chǎn)生ROS清除及抗炎活性，并改善電導(dǎo)率。Ti3C2Tx/LC水凝膠在促進(jìn)細(xì)胞定向排列、增殖和遷移、成肌分化和血管生成方面的顯著能力。在大鼠體積性肌肉損失模型中，Ti3C2Tx/LC水凝膠在促進(jìn)肌纖維形成、血管生成和功能恢復(fù)方面優(yōu)于未對(duì)齊的水凝膠，強(qiáng)調(diào)了其重現(xiàn)天然肌肉組織微環(huán)境的能力?？傊?，該仿生肽LC水凝膠支架有望成為促進(jìn)肌肉組織修復(fù)和神經(jīng)元再生的多功能治療平臺(tái)。

https://advanced.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.202500204

【通訊作者簡(jiǎn)介】

秦四勇，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事生物醫(yī)用材料的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究。2014年獲武漢大學(xué)高分子化學(xué)與物理博士學(xué)位（導(dǎo)師：卓仁禧院士、張先正教授），同年7月進(jìn)入貴州大學(xué)材料與冶金學(xué)院工作，次年4月加入中南民族大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院。主持國(guó)家自然科學(xué)基金2項(xiàng)、湖北省面上基金2項(xiàng)及教育部學(xué)術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目等近10項(xiàng)，參與國(guó)家/省部級(jí)重點(diǎn)項(xiàng)目多項(xiàng)。以第一/通訊作者在Coord. Chem. Rev., Angew. Chem. Int. Ed., ACS Nano等國(guó)際期刊發(fā)表論文40余篇，含ESI高被引論文2篇、熱點(diǎn)論文1篇，授權(quán)中國(guó)發(fā)明專利6項(xiàng)。曾獲教育部武漢大學(xué)博士學(xué)術(shù)新人獎(jiǎng)、湖北省優(yōu)秀博士學(xué)位論文、研究生國(guó)家獎(jiǎng)學(xué)金、武漢大學(xué)學(xué)術(shù)創(chuàng)新獎(jiǎng)一等獎(jiǎng)等榮譽(yù)。

黃蓉，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師。2014年獲得武漢大學(xué)有機(jī)化學(xué)博士學(xué)位, 2015年4月加入中南民族大學(xué)藥學(xué)院，致力于新型生物活性分子的創(chuàng)新發(fā)現(xiàn)與功能研究，以應(yīng)對(duì)腫瘤、耐藥性細(xì)菌感染及難治性自身免疫性疾病的臨床治療挑戰(zhàn)。主持2項(xiàng)國(guó)家自然科學(xué)基金，并參與10余項(xiàng)國(guó)家級(jí)和省部級(jí)科研項(xiàng)目。以第一作者或通訊作者身份在Adv. Funct. Mater., J. Control Release, Acta Biomater., Int. J. Biol. Macromol.等國(guó)際期刊發(fā)表論文30余篇，并授權(quán)6項(xiàng)國(guó)家發(fā)明專利。