丁烯醇ides是一類含有α,β-不飽和五元內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的化合物，廣泛存在于具有生物活性的天然產(chǎn)物中，也是多種合成藥物的重要藥效團(tuán)。其α,β-不飽和酯的親電性和γ-去質(zhì)子化產(chǎn)生的二烯醇鹽的親核性，使其成為構(gòu)建多樣化分子結(jié)構(gòu)的多功能合成模塊，因此一直是有機(jī)合成領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。目前丁烯醇ides的化學(xué)合成主要依賴兩種策略：一是通過分子內(nèi)或分子間環(huán)化反應(yīng)構(gòu)建核心骨架；二是通過對(duì)已構(gòu)建的呋喃酮前體進(jìn)行功能化修飾。然而，這些方法通常需要多個(gè)合成步驟和試劑，過程繁瑣、成本高昂且從可持續(xù)性角度看不夠理想。

近日，中國科學(xué)院微生物研究所周姍姍研究員團(tuán)隊(duì)在《Nature Communications》發(fā)表了題為《Trifunctional flavoenzyme-catalyzed asymmetric 4-alkyl-butenolide assembly in avenolide biosynthesis》的研究論文。該研究揭示了鏈霉菌中調(diào)控阿維菌素產(chǎn)生的激素分子avenolide的生物合成機(jī)制，發(fā)現(xiàn)一個(gè)三功能黃素酶能夠以脂肪酸酰基硫酯為底物，通過連續(xù)的去飽和、羥基化和內(nèi)酯化反應(yīng)，高效組裝手性4-烷基丁烯醇ide結(jié)構(gòu)。

研究團(tuán)隊(duì)首先在改造的Streptomyces albidoflavus宿主中異源表達(dá)avenolide生物合成基因savAB，成功實(shí)現(xiàn)了avenolide的高水平生產(chǎn)。通過高分辨率質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，在1?O?氣氛下培養(yǎng)的菌株產(chǎn)生的avenolide中，最多有三個(gè)氧原子被1?O標(biāo)記，表明分子中的三個(gè)氧原子來源于分子氧，為后續(xù)酶功能研究奠定了基礎(chǔ)。

為進(jìn)一步闡明SavA的功能，研究團(tuán)隊(duì)在大腸桿菌中表達(dá)了重組SavA蛋白并純化至均一。該蛋白呈黃色，UV-Vis吸收光譜顯示典型的氧化型黃素特征，經(jīng)鑒定其結(jié)合的輔因子為FAD。以化學(xué)合成的10-甲基十二烷酰泛酰巰基乙胺硫酯為底物進(jìn)行酶活測(cè)定，LC-MS分析發(fā)現(xiàn)主要產(chǎn)物為丁烯醇ide 3，同時(shí)檢測(cè)到少量α,β-不飽和中間體2。時(shí)間進(jìn)程分析顯示，隨著反應(yīng)時(shí)間延長，丁烯醇ide 3逐漸累積，而中間體2先增加后減少，證實(shí)2是反應(yīng)中間體。通過化學(xué)合成立體異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比，確定SavA催化生成的是單一手性的丁烯醇ide。

研究發(fā)現(xiàn)SavA催化丁烯醇ide形成不需要外源FAD或還原劑，表明其結(jié)合的FAD輔因子在反應(yīng)中僅起催化作用，分子氧是唯一的化學(xué)計(jì)量試劑。動(dòng)力學(xué)分析顯示，當(dāng)?shù)孜餄舛雀哂?00 μM時(shí)出現(xiàn)明顯的底物抑制效應(yīng)。進(jìn)一步通過1?O?標(biāo)記實(shí)驗(yàn)證實(shí)，丁烯醇ide環(huán)上的氧原子來源于分子氧。序列比對(duì)和AlphaFold3結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)合定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)表明，Glu418是催化α-質(zhì)子抽取的關(guān)鍵殘基，而Asp420雖對(duì)FAD結(jié)合重要但不直接參與催化。基于這些發(fā)現(xiàn)，研究團(tuán)隊(duì)提出了SavA的催化機(jī)制：首先進(jìn)行Z構(gòu)型α,β-去飽和反應(yīng)產(chǎn)生FADH2，F(xiàn)ADH2與O2反應(yīng)形成C4a-黃素氫過氧化物，然后對(duì)γ位進(jìn)行羥基化，最終自發(fā)內(nèi)酯化形成丁烯醇ide。

對(duì)于SavB的功能研究顯示，該P(yáng)450酶以SavA產(chǎn)生的丁烯醇ide 3為底物，在NADPH、鐵氧還蛋白和鐵氧還蛋白還原酶存在下，通過三步連續(xù)的區(qū)域和立體特異性羥基化反應(yīng)將其轉(zhuǎn)化為avenolide。時(shí)間進(jìn)程分析發(fā)現(xiàn)兩個(gè)中間產(chǎn)物11和12，通過NMR波譜鑒定11為C9羥基化中間體，12為其酮基衍生物。以分離的中間體為底物的酶活測(cè)定進(jìn)一步證實(shí)SavB按順序催化：先進(jìn)行C9單羥基化生成11，然后將11轉(zhuǎn)化為12（可能通過C9脫氫或二羥基化-脫水），最后進(jìn)行C10羥基化生成終產(chǎn)物avenolide。

中國科學(xué)院微生物研究所博士研究生李文睿和趙金蓮博士為該論文的共同第一作者，周珊珊研究員為文章通訊作者。該研究得到國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)和國家自然科學(xué)基金等項(xiàng)目的資助。

READING

BioPeers

歡迎關(guān)注本公眾號(hào)，所有內(nèi)容歡迎點(diǎn)贊，推薦??，評(píng)論，轉(zhuǎn)發(fā)~

如有錯(cuò)誤、遺漏、侵權(quán)或商務(wù)合作請(qǐng)私信小編~~

歡迎大家投稿課題組 研究進(jìn)展 、招聘及招生宣傳~

所有文章只為科普、科研服務(wù)，無商業(yè)目的~