撰文 | 林無隅

重組酶能夠介導(dǎo)千堿基級DNA在哺乳動物基因組中的精準插入，但通常需要大型雙鏈DNA（dsDNA）作為供體【1,2】。然而，胞質(zhì)中的dsDNA分子會觸發(fā)由cGAS-STING等傳感器介導(dǎo)的先天免疫反應(yīng)，導(dǎo)致嚴重的細胞毒性和低整合效率【3,4】。相比之下，單鏈DNA（ssDNA）具有更優(yōu)的免疫隱身特性和細胞耐受性，但大多數(shù)重組酶因其固有的雙鏈DNA結(jié)合特性而無法直接利用純單鏈模板進行有效整合【5,6】。這種對dsDNA供體的依賴性，長期以來限制了大片段基因組 編輯 技術(shù)在免疫 正常 環(huán)境（如體內(nèi)治療）中的應(yīng)用。因此，如何利用免疫隱身核酸與重組酶的協(xié)同作用實現(xiàn)安全、高效的大片段DNA整合，是該領(lǐng)域亟待解決的核心挑戰(zhàn)。

近日，美國馬薩諸塞州總醫(yī)院基因組醫(yī)學(xué)中心與病理系Benjamin P. leinstiver和Full Circles Therapeutics 公司的Hao Wu在Nature雜志上發(fā)表了Immune evasive DNA donors and recombinases license kilobase-scale writing的研究文章。研究人員開發(fā)了一種名為INSTALL（integration through nucleus-synthesized template addition of large lengths）的技術(shù)平臺，旨在利用免疫隱身單鏈DNA（ssDNA）供體實現(xiàn)千堿基級的基因組編輯。該研究通過設(shè)計環(huán)狀單鏈DNA（cssDNA）并在其上構(gòu)建短的局部雙鏈重組酶識別位點（oDNA），使大絲氨酸重組酶（LSRs）和RNA引導(dǎo)的重組酶能夠識別并整合大片段負載。實驗證明，INSTALL在人類原代細胞和活體小鼠中均實現(xiàn)了高效率、高保真的精準整合，且有效規(guī)避了dsDNA誘發(fā)的免疫防御機制。這一創(chuàng)新方案解決了大片段DNA非病毒遞送中的毒性瓶頸，為系統(tǒng)性基因治療提供了高效、安全的編輯工具。

研究者首先通過原代T細胞和活體小鼠實驗確證，大型dsDNA供體在入胞后會引發(fā)強烈的TNF和IL-6等炎癥因子釋放，而cssDNA或局部雙鏈的oDNA則表現(xiàn)出極高的免疫隱蔽性。為了讓重組酶能夠利用這些隱身模板，作者提出了INSTALL-2策略，即通過預(yù)退火短寡核苷酸在ssDNA供體上形成局部的雙鏈重組酶附著位點。測試數(shù)據(jù)表明，這種設(shè)計將整合效率比純單鏈模板提升了100倍以上，且細胞存活率顯著優(yōu)于傳統(tǒng)的dsDNA供體方案，實現(xiàn)了安全與效率的平衡。

隨后，研究人員驗證了INSTALL系統(tǒng)對多種重組酶（如Bxb1、Pa01）以及新型橋式重組酶（Bridge recombinase）的廣泛適用性，并在多種人類細胞系中取得了成功。通過長讀長測序（Long-read sequencing）及高通量靶向測序分析，結(jié)果顯示INSTALL介導(dǎo)的數(shù)千堿基序列插入具有極高的序列保真度和位點特異性，且未檢測到明顯的脫靶重組。此外，研究還證明了通過在重組酶上添加核定位信號（NLS）并結(jié)合主動入核機制，可以進一步優(yōu)化DNA供體在細胞核內(nèi)的富集與整合表現(xiàn)。

在活體層面，研究團隊利用脂質(zhì)納米顆粒（LNP）將INSTALL系統(tǒng)遞送至含有預(yù)設(shè)靶位點的轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)。實驗發(fā)現(xiàn)，在導(dǎo)致dsDNA組小鼠100%死亡的高劑量下，oDNA組小鼠依然表現(xiàn)出良好的耐受性，并成功在肝臟等組織中實現(xiàn)了顯著的基因整合。進一步的化學(xué)修飾（INSTALL-2e）和CpG基序最小化設(shè)計進一步降低了TLR9介導(dǎo)的內(nèi)吞體免疫識別。這些結(jié)果充分展示了INSTALL在處理復(fù)雜體內(nèi)環(huán)境時的優(yōu)越性，證明了其在大片段缺失補救或復(fù)雜基因置換治療中的臨床應(yīng)用價值。

綜上所述，INSTALL平臺通過巧妙的“局部雙鏈化單鏈供體”策略，打破了重組酶技術(shù)對免疫原性dsDNA的依賴。這一突破性工作不僅從方法論上解決了非病毒大片段DNA整合效率與細胞毒性之間的長期矛盾，也極大地擴展了基因編輯技術(shù)的劑量窗口。其研究意義在于為需要在體內(nèi)進行大片段基因插入或替換的遺傳病治療提供了切實可行的技術(shù)路徑。未來，這種具備免疫逃逸能力的非病毒遞送平臺有望成為精準醫(yī)療領(lǐng)域的重要基礎(chǔ)設(shè)施。

https://doi.org/10.1038/s41586-026-10241-z

制版人： 十一

參考文獻

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