好消息：博士讀完了，基金本子寫完了。

壞消息：頭發(fā)沒熬過它們，提前提交了‘離職申請’。

以前覺得‘聰明絕頂’是個夸張的修辭，現(xiàn)在才知道，這是學術圈最寫實的畢業(yè)要求。

毛發(fā)變白治療困境亟待突破

白發(fā)是人類衰老的顯著標志之一，但其背后隱藏著復雜的生物學機制。毛發(fā)變白直接源于毛囊中功能性黑色素細胞的不足和黑色素生成能力的下降。白癜風、早發(fā)性白發(fā)、橋本甲狀腺炎等色素性疾病影響著全球0.5%至2%的人口，給患者帶來心理和生理上的雙重負擔。然而，由于毛囊黑色素細胞位于皮膚深層的真皮層，現(xiàn)有的大分子藥物經(jīng)皮遞送效率極低，而口服或靜脈注射對皮膚及皮膚附屬器疾病效果有限。傳統(tǒng)的透皮促滲劑會破壞皮膚屏障功能并引起刺激，微針技術雖能穿透角質(zhì)層，但頻繁使用會造成皮膚損傷。因此，開發(fā)高效、安全的生物大分子經(jīng)皮遞送系統(tǒng)成為治療毛發(fā)變白的關鍵瓶頸。

白頭發(fā)終于有救了

針對這一挑戰(zhàn)，上海交通大學金鑫副研究員、朱新遠教授團隊設計了一種基于聚合酪氨酸酶納米膠囊的透皮治療方案，可直接激活局部黑色素細胞并原位刺激黑色素生成。研究團隊通過優(yōu)化納米膠囊的尺寸和表面電位，顯著增強了皮膚滲透性并保持了酶活性。nTYRs能夠高效地將活性酪氨酸酶通過角質(zhì)層遞送至毛囊黑色素細胞，在小鼠和人類黑色素細胞模型、豬和人類皮膚模型中均實現(xiàn)了快速而顯著的毛發(fā)復色。研究還建立了一種免疫介導的內(nèi)源性白發(fā)小鼠模型，更真實地模擬了人類病理生理過程。相關論文以“Direct Activation of Follicular Melanocytes by Polymeric Tyrosinase Nanocapsules for Reversing Hair Graying”為題，發(fā)表在ACS Nano上。

示意圖1. 經(jīng)皮遞送的 nTYRs 通過促進原位黑色素生成，誘導毛發(fā)變白疾病中的毛發(fā)復色。

圖1. 經(jīng)皮遞送納米膠囊的合成與表征。(a) 經(jīng)皮遞送納米膠囊通過原位聚合法制備。以丙烯酰胺（AM）為單體、N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺（BIS）為交聯(lián)劑，通過原位聚合合成蛋白納米膠囊，得到以蛋白為核、PAM為聚合物殼層的納米膠囊。聚合物殼層的表面特性可通過調(diào)節(jié)單體比例和聚合時間進行定制。(b) 天然蛋白及具有負Zeta電位的納米膠囊的動態(tài)光散射結果。(c) 天然蛋白及不同尺寸納米膠囊的透射電鏡圖像。(d) 天然蛋白及不同尺寸納米膠囊的Zeta電位。數(shù)據(jù)表示為三次獨立實驗的均值±標準誤。

研究團隊首先系統(tǒng)探究了納米膠囊的透皮促滲機制。他們以白蛋白和聚丙烯酰胺為模型，合成了尺寸在20至200納米、表面電位在-10 mV至+20 mV范圍內(nèi)的一系列納米膠囊。動態(tài)光散射和透射電子顯微鏡表征顯示，天然蛋白的直徑約為6納米，而納米膠囊的直徑可從約20納米調(diào)控至200納米以上。通過添加帶氨基的陽離子單體，團隊成功調(diào)節(jié)了納米膠囊的表面電位。體外透皮實驗采用與人類皮膚結構高度相似的豬皮膚模型，結果發(fā)現(xiàn)：所有200納米以下的納米膠囊均顯示出比天然蛋白顯著增加的滲透深度，24小時后可穿過整個表皮甚至到達真皮層。值得注意的是，在相同尺寸下，帶正電位的納米膠囊表現(xiàn)出更優(yōu)異的促滲效果，能夠更深入地進入真皮層。其中，50納米的帶正電納米膠囊在真皮層的相對積累量達到25.78%，是唯一在該深度積累比例超過25%的組別。傅里葉變換紅外光譜分析顯示，正電性納米膠囊處理降低了角質(zhì)層中脂質(zhì)對應的吸收峰強度，表明其通過破壞脂質(zhì)雙層結構、形成水性通道來協(xié)助納米膠囊運輸?；诔叽绾捅砻骐娢贿@兩個關鍵因素，研究團隊建立了預測納米膠囊滲透系數(shù)的數(shù)學模型，該模型能夠根據(jù)納米膠囊的zeta電位、直徑和殼層材料參數(shù)預測其24小時的滲透深度，為后續(xù)系統(tǒng)設計提供了理論指導。

圖2. 納米膠囊的體外滲透性。(a) FITC標記納米膠囊滲透1、4、24小時后皮膚的共聚焦圖像。(b) 不同尺寸和Zeta電位納米膠囊的滲透深度。(c) 沿滲透路徑0-200 μm范圍內(nèi)納米膠囊的相對蓄積值。(d) 納米膠囊沿滲透路徑的相對蓄積分布比例。(e) 經(jīng)水、天然蛋白、NCs-20+、NCs-50+、NCs-100+、NCs-150+和NCs-200+處理24小時后角質(zhì)層脂質(zhì)含量的FT-IR光譜。(f) 具有不同表面特性和尺寸的納米膠囊在豬皮膚上表現(xiàn)出不同的滲透性。(g) 不同納米膠囊處理后皮膚的相對脂質(zhì)含量。(h,i) 具有負或正Zeta電位、尺寸小于250 nm的納米膠囊在24小時的滲透深度實驗數(shù)據(jù)與預測數(shù)據(jù)。

在確定了最佳透皮參數(shù)后，團隊合成了不同尺寸的帶正電酪氨酸酶納米膠囊。酶活性測試顯示，nTYR-20+和nTYR-50+的活性損失小于10%，而nTYR-100+的活性損失超過75%，nTYR-150+和nTYR-200+幾乎完全失活。這歸因于過厚的聚合物殼層阻礙了底物向酶活性中心的傳輸。在穩(wěn)定性方面，天然酪氨酸酶在60°C孵育0.5小時后活性損失超過86%，1小時后幾乎完全失活；而nTYR-20+和nTYR-50+在40°C處理1小時后活性損失小于20%，60°C處理1小時后損失小于60%。針對皮膚pH值從4到8的變化，nTYRs在不同pH環(huán)境下均表現(xiàn)出更穩(wěn)定的活性，尤其是在堿性條件下。綜合催化活性、滲透性和制備成本，研究團隊選擇nTYR-20+進行后續(xù)研究。

圖3. 不同尺寸nTYRs在不同條件下的酶活性。(a) DLS測量的TYR和nTYRs的尺寸。(b) 不同尺寸nTYRs在聚合物殼層制備后的酶活性保留率。(c) 天然TYR、nTYR-20+、nTYR-50+和nTYR-100+在40°C或60°C加熱處理0.5或1小時后的活性保留率。(d) 天然TYR、nTYR-20+、nTYR-50+和nTYR-100+在不同pH環(huán)境下的穩(wěn)定性。

為驗證nTYRs的安全性，團隊在五種細胞系上進行了細胞毒性測試，包括人角質(zhì)形成細胞、成纖維細胞以及三種黑色素細胞。結果顯示，TYR和nTYR處理48小時后的細胞毒性均在可接受范圍內(nèi)。流式細胞術結果表明，nTYRs在2小時內(nèi)被黑色素細胞攝取，且由于正電荷表面特性，nTYR組的熒光強度更高。共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，nTYR處理后，黑色素細胞的樹突數(shù)量顯著增加，樹突長度明顯增長，并出現(xiàn)二級或三級分支——這在PIG3 V細胞中尤為突出，nTYR組的平均樹突長度是PBS組的1.94倍。黑色素顆粒的觀察和定量分析證實，nTYR組細胞內(nèi)黑色素顆粒聚集體顯著更多、更大。在正常黑色素細胞中，nTYR組的黑色素顆粒相對量是TYR組的1.8倍?？傮w黑色素含量評估顯示，nTYRs的促黑色素生成能力優(yōu)于TYRs：在正常黑色素細胞中，nTYRs比PBS組增加了14%以上的黑色素含量；在白癜風細胞PIG3 V中，這一增幅高達22.3%。與經(jīng)典酪氨酸酶激活劑8-甲氧基補骨脂素相比，nTYRs在PIG1細胞中的促黑色素生成因子達到了3.72，而TYR僅為2.33。

圖4. nTYRs的促黑色素生成能力。(a) nTYRs通過增強局部黑素細胞的黑色素生成和黑色素小體轉(zhuǎn)運來促進原位色素沉著。(b-f) 8-MOP、TYR和nTYR在5種不同細胞（HaCaT細胞、L929細胞、HEM細胞、PIG1細胞和PIG3 V細胞）上的細胞毒性。(g,h) HEM細胞和PIG3 V細胞對TYRs和nTYRs的攝取。(i) 經(jīng)PBS、TYRs和nTYRs處理后3種不同黑素細胞的共聚焦圖像。(j-l) 經(jīng)PBS、TYRs和nTYRs處理后3種不同黑素細胞中黑色素顆粒的相對數(shù)量。(m-o) 3種不同黑素細胞樹突相對長度的統(tǒng)計結果。(p-r) 3種不同黑素細胞中黑色素增加率及與8-MOP相比的促進因子。

透皮滲透實驗進一步證實，nTYRs比TYRs具有更深的皮膚滲透能力，能夠到達真皮層。在三維人表皮模型EpiKuits上，nTYRs處理24小時后可到達表皮模型底部，而TYR的熒光信號主要停留在模型上層。三維人黑色素皮膚模型MelaKuits的結果進一步確認了nTYRs的透皮滲透性和促黑色素生成能力。

圖5. nTYR的經(jīng)皮滲透性。(a-c) FITC標記的TYR和nTYR在豬皮膚中滲透1、4和24小時后的分布。(d) FITC標記的TYR和nTYR在EpiKuits模型中滲透24小時后的分布。

研究團隊隨后在白發(fā)小鼠模型中驗證了nTYRs誘導毛發(fā)復色的療效。他們利用B16F10黑色素瘤細胞在C57BL/6小鼠背部誘導局部CD8+ T細胞過表達，建立了模擬人類白發(fā)患者毛囊周圍微環(huán)境的內(nèi)源性白發(fā)模型。經(jīng)過20天的局部給藥，nTYRs處理組小鼠皮膚的角質(zhì)層保持了與對照組相同的微形態(tài)特征，表皮厚度和皮膚厚度變化可忽略不計，且未顯示任何全身毒性跡象。新生毛發(fā)的超景深顯微鏡觀察顯示，nTYR組出現(xiàn)了更明顯的深色毛發(fā)，表明nTYR對毛囊色素沉著的影響不僅體現(xiàn)在毛干上，也體現(xiàn)在新生毛發(fā)的深色尖端。通過對背部給藥區(qū)域進行分區(qū)定量分析，nTYR組在脫色面積擴展和色差增加方面均表現(xiàn)出明顯的緩解效果，尤其在遠離手術區(qū)域的第3區(qū)，nTYRs對脫色擴散的緩解趨勢更為顯著。組織學分析顯示，nTYRs促進了毛囊生長，毛囊數(shù)量增加了73.4%，毛囊長度增加了90.5%。黑色素染色結果顯示，nTYR組毛囊中的毛干出現(xiàn)了明顯的色素沉著。

圖6. 基于nTYR的治療對毛發(fā)變白小鼠逆轉(zhuǎn)毛發(fā)變白和誘導復色的效果。(a) 實驗設計示意圖。(b,d) 陰性對照組、未處理對照組、PBS組和nTYR組從毛發(fā)變白早期到進展期剃毛區(qū)域的脫色情況。(c) 小鼠背部剃毛的超景深顯微鏡照片。(e) 剃毛區(qū)域分區(qū)示意圖。(fg) 各組脫色色差和面積比的分區(qū)及整體統(tǒng)計。

與臨床白癜風藥物魯索替尼及天然酪氨酸酶的對比研究顯示，盡管魯索替尼減少了毛囊周圍的CD8+ T細胞積聚，但黑色素細胞的保留仍然不足；而nTYR組則表現(xiàn)出更好的黑色素細胞保留。在脫色面積擴散和色差增加的緩解能力上，nTYRs均顯著優(yōu)于魯索替尼和天然TYR。nTYR組的平均色差變化為5.87，僅為TYR組的30.2%。TYR組較弱的脫色緩解效果可能歸因于其經(jīng)皮遞送效率低、細胞攝取能力差以及酶活性損失。此外，由于活動性白癜風患者體內(nèi)存在酪氨酸酶抗體，TYR可能被識別和清除。相比之下，nTYRs即使在CD8+ T細胞攻擊未被抑制的情況下，仍顯示出激活存活休眠黑色素細胞的潛力。

圖7. nTYR組與蘆可替尼組、nTYR組與TYR組的復色效果比較。(a) 各組小鼠皮膚H&E染色和Masson-Fontana染色圖像。(b,c) 未處理對照組、PBS組、蘆可替尼組、TYR組和nTYR組的脫色色差和面積比。(d,e) 未處理對照組、PBS組、蘆可替尼組、TYR組和nTYR組的毛囊數(shù)量和長度。(f) nTYR組小鼠皮膚Masson-Fontana染色放大圖像。(g) PBS組、蘆可替尼組、TYR組和nTYR組小鼠皮膚中CD8+ T細胞和黑素細胞的免疫熒光圖像。

本研究開發(fā)的高效經(jīng)皮遞送酪氨酸酶納米系統(tǒng)為直接治療毛發(fā)變白提供了有前景的新策略。nTYRs對黑色素細胞的激活機制值得進一步深入研究，該策略不僅有望用于毛囊復色，還可拓展至更廣泛的皮膚復色場景，如白癜風。值得注意的是，盡管nTYRs不靶向黑色素細胞功能障礙的上游發(fā)病機制，但其直接的促黑色素生成能力和黑色素細胞激活效應與現(xiàn)有療法并不沖突，具有良好的協(xié)同應用潛力。此外，該納米載體系統(tǒng)及建立的滲透模型為基于納米膠囊和納米凝膠的經(jīng)皮藥物遞送提供了新的理論描述，其應用可超越毛發(fā)變白，拓展至其他皮膚疾病的生物大分子經(jīng)皮遞送。面向臨床轉(zhuǎn)化，殼層材料的設計需根據(jù)蛋白質(zhì)載貨要求、目標滲透深度和體內(nèi)生物降解行為進行定制，未來的材料選擇應在生物安全性和組裝兼容性之間取得平衡，以優(yōu)化轉(zhuǎn)化潛力。