本文系Food Science and Human Wellness原創(chuàng)編譯，歡迎分享，轉(zhuǎn)載請授權(quán)。

Introduction

在衡量個體健康和生活質(zhì)量方面，衰老和記憶障礙是兩個關(guān)鍵因素。衰老是一個不可避免的過程，會導致某些器官，特別是大腦的退化。D-半乳糖（D-gal）是一種還原糖，研究表明它可以在短時間內(nèi)建立一種安全的嚙齒動物衰老模型。該模型表現(xiàn)出與人類自然衰老相似的行為、神經(jīng)和生化缺陷。因此，D-gal可用于篩選針對神經(jīng)退行性疾病（包括記憶障礙）的抗衰老藥物。食物來源的肽可用于日常膳食補充劑以促進健康。這些肽具有食用安全、來源方便、生產(chǎn)過程簡單和強大的功能活性等特點。本研究旨在調(diào)查DHM水解產(chǎn)物（DHMH）的抗氧化能力，并評估DHMH補充劑對D-gal誘導的小鼠記憶障礙中行為、神經(jīng)炎癥和氧化應激效應的潛在保護作用。為深入了解堅果蛋白酶水解產(chǎn)物增強記憶的機制，本研究還探討了DHMH對神經(jīng)元和突觸的神經(jīng)保護作用。

Results and Discussion

山核桃粕酶解多肽的分子量分布

如表1所示，山核桃粕酶解產(chǎn)物的分子量主要低于3 kDa，占總蛋白成分的約97.22%。蛋白酶的作用促進了嵌入蛋白質(zhì)基質(zhì)中的生物活性肽的釋放。此前報道，分子量低于3 kDa的肽相比于較大分子量的肽，表現(xiàn)出更高的抗氧化活性和其他有益的生理效應。這種增強的功效可能歸因于較小分子與自由基結(jié)合的親和力更高，從而減輕了這些自由基引起的過氧化作用。這些結(jié)果表明，堿性蛋白酶能有效將山核桃蛋白分解為小分子肽或游離氨基酸，所得水解產(chǎn)物表現(xiàn)出顯著的抗氧化特性。

表1 脫脂山核桃粕水解產(chǎn)物的分子量分布

氨基酸組成測定

測得的水解氨基酸、游離氨基酸和額外氨基酸的水平分別為（2107.97 ± 760.03）、（775.56 ± 27.87）和1332.41 μg/g。值得注意的是，山核桃粕酶解產(chǎn)物的谷氨酸和酪氨酸含量最高，分別為（133.59 ± 3.09）和（130.08 ± 8.23）μg/g，詳見表2。谷氨酸是哺乳動物大腦中最豐富的氨基酸，作為興奮性神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)揮作用。此外，它在腦能量代謝、GABA和谷胱甘肽合成以及氨清除中起著關(guān)鍵作用。谷氨酰胺由谷氨酸和氨結(jié)合形成，可以穿過血腦屏障。在大腦中，谷氨酰胺合成酶（GS）負責大部分內(nèi)源性谷氨酰胺的產(chǎn)生。Chen等人進行的一項研究表明，向兩種阿爾茨海默病動物模型補充谷氨酰胺，可導致與腦功能障礙相關(guān)的各種生化標志物減少。具體而言，觀察到炎癥引起的神經(jīng)元細胞周期激活、tau磷酸化和ATM激活減少。這些結(jié)果表明，谷氨酰胺補充劑可能在緩解阿爾茨海默病相關(guān)功能障礙方面具有潛在益處，并提示DHMH中同樣富含的氨基酸可以穿過血腦屏障，有助于增強記憶。

表2 脫脂山核桃粕水解產(chǎn)物的氨基酸組成和含量

DHMH的體外抗氧化活性

PPH是一種以氮為中心的相對穩(wěn)定且全面的方法，用于快速評估物質(zhì)的抗氧化活性。如圖1a所示，DHMH、DHM和GSH的DPPH自由基清除活性按DHMH＞DHM＞GSH的順序增加。這些發(fā)現(xiàn)突出了DHMH在清除自由基方面的卓越功效，使其成為一種有前景的天然抗氧化劑。此外，DHMH對DPPH自由基表現(xiàn)出顯著的清除能力。

氫供體和斷鏈化合物的抗氧化活性可通過常規(guī)ABTS自由基測試有效評估，這是一種評估這些化合物的寶貴方法。如圖1b所示，觀察到明顯的劑量效應關(guān)系，隨著濃度在特定范圍內(nèi)增加，有毒ABTS肽的清除率也隨之增加。值得注意的是，在0.4 mg/mL濃度下，DHMH對ABTS的清除效果超過GSH 40%以上，并且是DHM的兩倍。

電子轉(zhuǎn)移能力可通過羥基自由基中和的速度以及還原能力來證明，兩者都可作為抗氧化功效的指標。山核桃粕酶解產(chǎn)物的抗氧化潛力通過電子轉(zhuǎn)移和氫轉(zhuǎn)移評估得到有效證明。值得注意的是，DHMH表現(xiàn)出最強的自由基清除能力，其次是DHM。在相同濃度范圍內(nèi)，谷胱甘肽的抗氧化能力顯著優(yōu)于其他兩種化學物質(zhì)。

圖1 DHMH的體外抗氧化活性

DHMH對腦功能的影響

DHMH對小鼠體質(zhì)量增加和器官指數(shù)的影響

根據(jù)飼喂期間記錄的小鼠體質(zhì)量和解剖過程中記錄的器官重量，計算了表3中的實驗結(jié)果。結(jié)果顯示，模型組小鼠的體質(zhì)量變化顯著低于對照組（P＜0.001）。這表明D-gal對小鼠體質(zhì)量增加具有一定的抑制作用。然而，與對照組相比，口服DHMH治療的小鼠體質(zhì)量變化無顯著差異（P＞0.05）。此外，在器官指數(shù)測量方面，口服DHMH治療的小鼠肝臟、腎臟和脾臟器官指數(shù)與對照組相比也無顯著差異（P＞0.05）。這表明口服DHMH對小鼠器官無顯著影響。綜合體質(zhì)量變化和器官指數(shù)的結(jié)果推斷，DHMH是一種安全產(chǎn)品，副作用極小。

表3 小鼠體質(zhì)量變化量和器官指數(shù)

DHMH對MWM中空間記憶的影響

水迷宮測試結(jié)果顯示，D-gal治療組小鼠的潛伏期顯著延長（（58.27 ± 5.48）s），比對照組（（12.18 ± 4.52）s）延長了46.01 s（P＜0.001），如圖2a所示。此外，水中的總游泳距離顯著增加（P＜0.001，圖2b），表明D-gal每日腹腔注射加速了衰老并嚴重損害了學習和記憶能力。這些發(fā)現(xiàn)證實了衰老模型的成功建立。與模型組相比，服用山核桃粕水解產(chǎn)物的小鼠成功找到平臺的頻率增加。特別是，DHMH-H組的逃逸潛伏期顯著減少（（35.13 ± 17.18）s），下降了37.9%（P＜0.001）。在DHMH-H組中，到平臺的總距離從（917 ± 161）mm顯著縮短到（525 ± 172）mm（P＜0.01）。這些結(jié)果表明，山核桃粕水解產(chǎn)物可以減緩小鼠的衰老過程，并增強其在水迷宮任務(wù)中的學習和記憶能力。

圖2 DHMH飼喂對D-gal處理小鼠（a）逃逸潛伏期、（b）總游泳距離的影響，以及（c）第5天MWM測試中的軌跡

空間探測測試

圖3展示了小鼠空間探索測試結(jié)果，揭示治療組小鼠（（12.28 ± 7.42）%）在目標象限中的活動時間百分比顯著低于對照組小鼠（（28.52 ± 14.90）%）（P＜0.001，圖3a），導致在目標象限中花費的時間百分比比對照組減少了16.24%。相比之下，DHMH-H組小鼠在目標象限中的停留時間延長（（34.57 ± 11.67）%），比D-gal治療組增加了22.3%（P＜0.001）?？臻g探索和位置導航測試的結(jié)果一致，支持DHMH能增強小鼠記憶的觀點，且高劑量下效果更顯著。MWM測試結(jié)果表明，D-gal治療組小鼠的學習和記憶能力與對照組相比顯著下降。這與之前報道的D-gal長期治療對小鼠學習和記憶功能產(chǎn)生不利影響的研究一致。重要的是，DHMH減輕了D-gal對學習和記憶能力的有害影響。

圖3 DHMH飼喂對D-gal處理小鼠（a）目標象限百分比和（b）第5天MWM測試中的軌跡的影響

DHMH抑制D-gal誘導的小鼠Aβ1-42積累

衰老過程通過破壞對Aβ代謝至關(guān)重要的內(nèi)體/溶酶體轉(zhuǎn)運途徑，干擾了驅(qū)動蛋白和動力蛋白之間的相互作用，導致Aβ的細胞內(nèi)積累。這種破壞主要受氧化應激和神經(jīng)炎癥等因素的影響。此外，Aβ1-42現(xiàn)在被認為是細胞外淀粉樣變性的主要成分，并與神經(jīng)元內(nèi)的病變有關(guān)。作為Aβ的一種常見亞型，Aβ1-42具有強毒性和易于聚集的特點，可觸發(fā)Aβ斑塊沉積、神經(jīng)毒性、突觸損傷和神經(jīng)元死亡，從而導致AD的發(fā)生。根據(jù)圖4所示數(shù)據(jù)，模型組和對照組小鼠海馬體中Aβ1-42含量存在顯著差異（P＜0.001）。模型組Aβ1-42含量最高（10.00 ng/mL），比對照組增加了37.9%，進一步驗證了模型的成功構(gòu)建。經(jīng)口服山核桃殘渣酶解產(chǎn)物治療后，Aβ1-42水平有一定程度的下降。至于口服山核桃殘渣酶解產(chǎn)物組，Aβ1-42含量分別達到9.26、8.83和8.31 ng/mL。特別是，DHMH-H組與模型組之間存在顯著差異（P＜0.01），表明高劑量山核桃殘渣酶解產(chǎn)物在預防Aβ1-42蛋白聚集方面具有顯著作用。

圖4 DHMH飼喂對D-gal處理小鼠大腦中Aβ1-42水平的影響

DHMH對氧化應激的影響

與衰老相關(guān)的認知能力下降與氧化應激的影響密切相關(guān)。因此，研究了DHMH對D-gal誘導小鼠氧化還原失衡的影響。作為脂質(zhì)過氧化的生物標志物，模型組血清中的MDA濃度顯著升高（（15.35 ± 2.72）nmol/mL，圖5a）。同時，細胞抗氧化系統(tǒng)主要成分GSH、GSH-PX和SOD的水平同步下降（分別為（4.38 ± 0.21）mg GSH/L、（1224.73 ± 29.48）U/mL和（306.60 ± 40.48）U/mL）（圖5b-d）。這與之前的研究結(jié)果一致，即認知缺陷小鼠大腦中SOD和GSH-PX活性降低，MDA水平升高。然而，高劑量DHMH補充劑有效緩解了D-gal誘導的MDA升高以及GSH、GSH-PX和SOD水平的降低（分別為（9.78 ± 1.73）nmol/mL、（4.97 ± 0.27）mg GSH/L、（1303.35 ± 20.31）U/mL和（409.39 ± 33.4）U/mL）（圖5）。SOD活性和MDA含量分別反映了小鼠的抗氧化能力和神經(jīng)元損傷程度?？寡趸芰υ綇姡瑢毎谋Ｗo作用越大，間接反映了對小鼠學習和記憶的影響。同樣，據(jù)報道，海參肽治療后，小鼠血清SOD活性升高，MDA水平下降，小鼠在腦行為測試中表現(xiàn)良好。結(jié)合本研究結(jié)果，DHMH有效緩解了D-gal誘導的氧化應激，顯示出其作為預防措施的潛力。

圖5 DHMH飼喂對D-gal處理小鼠血清中（a）MDA和（b）GSH水平，（c）GSH-PX和（d）SOD活性的影響

DHMH對神經(jīng)炎癥因子的影響

衰老引起的認知障礙中，代表性的炎癥標志物包括IL-1β、IL-6和TNF-α，突出了神經(jīng)炎癥在此過程中的重要作用。更多證據(jù)表明，炎癥是Aβ神經(jīng)毒性和AD的主要原因之一。與對照組相比，D-gal誘導大腦中IL-1β、IL-6和TNF-α的表達顯著增加（分別為（259.56 ± 10.18）、（279.13 ± 45.54）和（1196.77 ± 57.89）pg/mL）（圖6），而高劑量DHMH給藥顯著逆轉(zhuǎn)了這些變化（分別為（193.56 ± 35.67）、（180.71 ± 28.46）和（934.60 ± 57.25）pg/mL）（圖6）。這些結(jié)果表明，DHMH補充劑降低了D-gal誘導的小鼠海馬體和皮層中的神經(jīng)炎癥。實驗證據(jù)表明，DHMH可能潛在地改善D-gal誘導的衰老效應。

圖6 DHMH飼喂對D-gal處理小鼠大腦中（a）IL-1β、（b）IL-6和（c）TNF-α水平的影響

DHMH對海馬神經(jīng)元的影響

許多腦部疾病是由大腦皮層和海馬體的神經(jīng)元和突觸缺陷引起的。在對照組中，海馬體CA1區(qū)的神經(jīng)元（圖7a）呈現(xiàn)出組織良好、細胞結(jié)構(gòu)完整、細胞核和細胞質(zhì)清晰的排列。然而，D-gal給藥導致海馬體CA1區(qū)（圖7b）的排列紊亂和松散。然而，在高劑量山核桃粕酶解產(chǎn)物灌胃后，觀察到海馬體CA1區(qū)病變得到緩解（圖7c）。一項研究表明，記憶喪失與海馬錐體細胞破壞和核萎縮有關(guān)。海馬體CA1區(qū)特別參與空間定向相關(guān)訓練特異性記憶?；谛袨閷嶒灐⑸笜撕蛯π∈蠛ｑR體的H&E觀察，DHMH無疑有效緩解了D-gal誘導的海馬細胞損傷，從而盡可能維持細胞活力和完整性，并提高小鼠記憶能力。

圖7 DHMH飼喂對D-gal處理小鼠海馬神經(jīng)元的影響

DHMH對D-gal誘導的突觸結(jié)構(gòu)損傷的影響

PSD-95是一種支架蛋白，維持突觸連接并影響突觸可塑性。PSD-95表達下降可能導致突觸功能障礙和學習記憶能力下降。神經(jīng)發(fā)育過程中的突觸功能障礙與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生密切相關(guān)。D-gal暴露對小鼠海馬體的突觸結(jié)構(gòu)有害，導致突觸后密度下降。

通過Western blotting（WB）和免疫組織化學分析，確定了DHMH干預對小鼠腦組織中PSD-95表達的影響。圖8a表示PSD-95的WB結(jié)果。WB結(jié)果顯示，與對照組（（87.36 ± 4.52）%）相比，模型組海馬體中PSD-95的相對表達（（59.05 ± 6.61）%）下降了28.31%（圖8b）。有趣的是，高劑量DHMH有效增加了記憶障礙小鼠海馬體中突觸功能蛋白PSD-95的相對含量（（102.34 ± 6.62）%）（圖8b）。

在免疫組織化學中，PSD-95陽性細胞以顆粒狀形式呈棕色（圖8c），在D-gal治療組（0.00360 ± 0.00184）中的平均密度顯著低于對照組（0.05070 ± 0.00934）（圖8d），表明D-gal可以抑制PSD-95蛋白的表達。DHMH干預后，PSD-95染色的平均密度顯著增加（0.02390 ± 0.00591）（圖8d）。這些結(jié)果表明，DHMH飲食可以有效糾正D-gal引起的損傷并恢復突觸功能。

圖8 DHMH對D-gal誘導小鼠突觸結(jié)構(gòu)損傷的影響

Conclusion

本研究調(diào)查了D-gal誘導的小鼠衰老模型中DHMH的神經(jīng)保護作用。DHMH通過酶解脫脂山核桃粕制備，具有強大的抗氧化和自由基清除特性。在D-gal誘導的記憶障礙小鼠模型中，DHMH顯著改善了記憶缺陷。MWM測試顯示，DHMH治療小鼠的學習和記憶效果增強，表現(xiàn)為逃逸潛伏期和總游泳距離的縮短。此外，DHMH還提高了抗氧化酶活性，減少了D-gal引起的氧化損傷，并同時緩解了Aβ1-42的積累和炎癥細胞因子，這些都與阿爾茨海默病有關(guān)。免疫組織化學檢查表明，DHMH促進了海馬神經(jīng)元的再生，而蛋白分析揭示了海馬中PSD-95表達降低的預防作用是其潛在的作用機制?？傮w而言，DHMH在緩解認知障礙方面顯示出前景，并有可能進一步開發(fā)用于針對認知功能障礙的營養(yǎng)保健品。

Defatted hickory meal hydrolysate’s impact on memory impairment induced by D-galactose in mice

Fanping Qin1, Ruiling Liu1, Qi Kong1, Hangjun Chen, Xiangjun Fang, Huizhi Chen, Weijie Wu*, Haiyan Gao*

State Key Laboratory for Managing Biotic and Chemical Threats to the Quality and Safety of Agro-products, Zhejiang Key Laboratory of Intelligent Food Logistic and Processing, Key Laboratory of Post-Harvest Fruit Processing, Key Laboratory of Post-Harvest Vegetable Preservation and Processing (Co-Construction by Ministry and Province), Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Key Laboratory of Light Industry Fruit and Vegetable Preservation and Processing, Institute of Food Science, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China

1 Both authors contributed equally.

*Corresponding author.

Abstract

Defatted hickory meal (DHM), a by-product of hickory oil production, is a protein source rich in essential amino acids. In this study, the functional properties of DHM hydrolysate (DHMH) were assessed using in vitro and in vivo assays in context to its antioxidant and memory-enhancing effects. To induce memory impairment, D-galactose (D-gal) was administered to mice at a dose of 120 mg/kg body weight per day, and DHMH was orally administered at doses of 300, 600, and 1000 mg/kg body weight per day for 8 weeks. DHMH treatment led to improved memory performance in D-gal-induced memory-impaired mice, as observed in the Morris water maze test. Furthermore, DHMH mitigated the accumulation of amyloid β1-42 triggered by D-gal exposure. Notably, high-dose DHMH significantly reduced the elevation of pro-inflammatory markers, including tumor necrosis factor alpha, interleukin 1β, and interleukin 6. Additionally, DHMH prevented the decline in total superoxide dismutase activity, glutathione peroxidase activity, and glutathione levels, while reducing malondialdehyde content in D-gal-induced mice, indicative of its antioxidant properties. Moreover, DHMH treatment effectively prevented histological alterations in neurons within the hippocampal CA1 area induced by D-gal. Collectively, our findings suggest that DHMH may counteract memory dysfunctions resulting from oxidative stress injury in the brain, positioning it as a potential candidate for use as a functional food.

Reference:

QIN F P, LIU R L, KONG Q, et al. Defatted hickory meal hydrolysate’s impact on memory impairment induced by D-galactose in mice[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(5): 9250195. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250195.

翻譯： 管勤昊 （實習）

編輯：梁安琪；責任編輯：孫勇

封面圖片：攝圖網(wǎng)

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