摘要:這項(xiàng)研究首次解析了肺炎鏈球菌22A血清型莢膜多糖的重復(fù)單元結(jié)構(gòu)，明確其與疫苗覆蓋型22F的核心結(jié)構(gòu)差異，同時(shí)證實(shí)O-乙?；?/strong>是抗體識(shí)別的關(guān)鍵位點(diǎn)。研究通過多糖結(jié)構(gòu)解析、結(jié)合疫苗制備與兔免疫實(shí)驗(yàn)，揭示22A與22F存在交叉免疫反應(yīng)，為肺炎鏈球菌多價(jià)疫苗的優(yōu)化設(shè)計(jì)提供了直接實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

被忽視的非疫苗血清型22A

肺炎鏈球菌是引發(fā)侵襲性肺炎鏈球菌病的主要致病菌，在兒童和老年群體中致病風(fēng)險(xiǎn)極高。22A血清型屬于非疫苗血清型，在烏干達(dá)等地區(qū)是腦膜炎的主要致病型，卻長期未被主流疫苗覆蓋。它和疫苗包含的22F血清型親緣關(guān)系極近，學(xué)界一直沒摸清二者的精細(xì)結(jié)構(gòu)差異。這也是團(tuán)隊(duì)啟動(dòng)這項(xiàng)研究的核心原因，想把22A的多糖結(jié)構(gòu)徹底捋清楚。

22A多糖結(jié)構(gòu)：精準(zhǔn)驗(yàn)證與核心差異

團(tuán)隊(duì)用化學(xué)衍生、高分辨質(zhì)譜、核磁共振波譜三套技術(shù)，完成了22A莢膜多糖的結(jié)構(gòu)驗(yàn)證。最終確定其重復(fù)單元為：[→3)-β-D-半乳呋喃糖-(1→2)-α-L-鼠李糖-(1→4)-β-D-葡萄糖醛酸-(1→4)-(α-D-半乳糖吡喃糖-(1→3))-β-L-鼠李糖-(2-OAc)(1→4)-β-D-葡萄糖-(1→]n。

圖1 22A血清型CPS重復(fù)單元結(jié)構(gòu)

22A和22F的骨架高度相似，唯一區(qū)別在側(cè)鏈：22A是α-D-半乳糖吡喃糖，22F是α-D-葡萄糖吡喃糖。單糖組成分析也印證了這一點(diǎn)，鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸的比例完全匹配結(jié)構(gòu)推導(dǎo)結(jié)果。

圖3 22A單糖組成分析

表1 去O-乙?；?2A CPS碳?xì)浠瘜W(xué)位移歸屬

GC-MS鎖定關(guān)鍵結(jié)構(gòu)片段

多糖經(jīng)還原、甲基化、水解、乙酰化后，通過GC-MS檢測到6種主要衍生物。其中1,5-二-O-乙?；?2,3,4,6-四-O-甲基半乳糖醇，直接證明22A側(cè)鏈?zhǔn)前肴樘沁拎?。這是區(qū)分22A與22F最直接的化學(xué)證據(jù)，不用再靠光譜間接推測。

圖4 衍生化22A單糖GC-MS分析

兩種血清型的一維氫譜整體輪廓接近，都能看到乙酰基和6-脫氧單糖的甲基信號。糖環(huán)質(zhì)子區(qū)的細(xì)微差別，剛好對應(yīng)側(cè)鏈單糖的不同。坦白講，這種細(xì)微的光譜差異，只有結(jié)合質(zhì)譜才能精準(zhǔn)解讀。

圖2 22F與22A 1D 1H NMR對比

O-乙酰化：抗體識(shí)別的核心位點(diǎn)

22A的O-乙?；?/strong>修飾位于β-L-鼠李糖的C2位，乙酰甲基信號在2.16 ppm處。去掉這個(gè)修飾后，對應(yīng)的質(zhì)子信號會(huì)明顯向高場移動(dòng)，多糖的抗原特征直接改變。

圖7 天然22A CPS NMR歸屬

表2 天然22A CPS碳?xì)浠瘜W(xué)位移歸屬

團(tuán)隊(duì)做了去乙?；瘜φ諏?shí)驗(yàn)，結(jié)果很直觀。O-乙?；皇强捎锌蔁o的修飾，它直接參與抗體結(jié)合的表位形成。很多細(xì)菌多糖的O-乙?；加羞@個(gè)作用，22A也不例外。

免疫原性：交叉反應(yīng)與疫苗潛力

研究用CDAP活化法，把22A和22F多糖分別與CRM197載體蛋白結(jié)合，制備成結(jié)合疫苗。選用6只新西蘭兔為一組，按0、14天程序免疫，28天采血檢測抗體。

圖8 22A與22F CPS結(jié)合疫苗免疫評價(jià)

兩種疫苗都能誘導(dǎo)出高滴度的特異性IgG，多糖芯片實(shí)驗(yàn)顯示二者存在明顯交叉反應(yīng)。去掉O-乙?；?，抗體結(jié)合強(qiáng)度直接腰斬。這說明制備22A疫苗時(shí)，必須保留O-乙?；揎棧拍鼙ＷC免疫效果。

給疫苗設(shè)計(jì)的實(shí)用參考

22A作為高發(fā)的非疫苗血清型，已經(jīng)成為疫苗迭代的重要目標(biāo)。這項(xiàng)研究把它的結(jié)構(gòu)徹底錨定，也明確了和22F的差異邊界。側(cè)鏈單糖的替換、O-乙酰化的保留，都是疫苗研發(fā)不能忽略的細(xì)節(jié)。

某種程度上，細(xì)菌多糖的免疫特性，就藏在這些細(xì)微的結(jié)構(gòu)里。后續(xù)開發(fā)更高價(jià)的肺炎疫苗，完全可以把22A納入覆蓋范圍，依托和22F的交叉反應(yīng)，提升疫苗的保護(hù)廣度。

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