2026年3月31日，北京中醫(yī)藥大學(xué)李曉驕陽(yáng)教授以獨(dú)立通訊在Targetome (Targetome是中國(guó)藥科大學(xué)的官方期刊，該期刊致力于聚焦開創(chuàng)性研究，旨在發(fā)現(xiàn)具有轉(zhuǎn)化潛力的新型治療靶點(diǎn)，推動(dòng)藥物研發(fā)創(chuàng)新，并促進(jìn)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展。)在線發(fā)表題為“Acteoside mitigates hepatic ischemia-reperfusion injury by targeting CMPK2-intervened redox metabolism”（毛蕊花糖苷通過靶向 CMPK2 介導(dǎo)的氧化還原代謝來減輕肝臟缺血再灌注損傷）的研究論文。

【通訊作者】李曉驕陽(yáng)，北京中醫(yī)藥大學(xué)教授、博導(dǎo)、博士后合作導(dǎo)師、美國(guó)弗吉尼亞聯(lián)邦大學(xué)博士后及高級(jí)訪問學(xué)者，現(xiàn)任北京中醫(yī)藥大學(xué)科研處副處長(zhǎng)兼任期刊中心副主任。 獲得國(guó)家高層次人才特殊支持計(jì)劃、青年岐黃學(xué)者、全球前2%頂尖科學(xué)家、北京市科技新星、中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)青年科技創(chuàng)新獎(jiǎng)獲得者、中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)青年人才托舉工程（A類）獲得者、北京中醫(yī)藥大學(xué)人才A崗及壺天青年學(xué)者。現(xiàn)為國(guó)家中醫(yī)藥管理局高水平中醫(yī)藥重點(diǎn)學(xué)科中醫(yī)疫病學(xué)學(xué)科方向帶頭人、國(guó)家中醫(yī)藥傳承創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)、北京中醫(yī)藥薪火傳承“新3+3”工程趙紹琴“三名”傳承工作室重點(diǎn)培養(yǎng)人才。兼任中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)感染病分會(huì)副秘書長(zhǎng)、中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)肝膽病分會(huì)青年副主任委員、中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)青年委員會(huì)委員等。

研究方向：中醫(yī)藥防治慢性肝�。ǜ卫w維化、非酒精性脂肪肝、肝癌等）功效機(jī)理解析

主要成果：主持10余項(xiàng)國(guó)家及省部級(jí)題，以通訊或第一作者在Journal of Hepatology、Science Bulletin、Hepatology、Theranostics、APSB等知名期刊發(fā)表論文90余篇（IF＞10分25篇），他引3800余次（2篇ESI高被引，3次獲Editorial Comments，3次獲封面文章）。依托相關(guān)成果入選國(guó)際F1000Prime庫(kù)、梅斯醫(yī)學(xué)中國(guó)十大醫(yī)學(xué)研究、中國(guó)精品科技期刊頂尖學(xué)術(shù)論文F5000、國(guó)際中醫(yī)藥與傳統(tǒng)醫(yī)藥高影響力研究、美國(guó)肝病協(xié)會(huì)組委會(huì)研究獎(jiǎng)及青年科學(xué)研究學(xué)者獎(jiǎng)。授權(quán)專利19項(xiàng)、軟著3項(xiàng)、團(tuán)標(biāo)3項(xiàng)，獲得教育部科學(xué)研究?jī)?yōu)秀成果獎(jiǎng)二等獎(jiǎng)、省科學(xué)技術(shù)進(jìn)步一等獎(jiǎng)2次及中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)青年科技創(chuàng)新獎(jiǎng)等。作為指導(dǎo)教師指導(dǎo)學(xué)生入選中國(guó)科協(xié)首屆青年人才托舉工程博士生專項(xiàng)計(jì)劃、北京中醫(yī)藥大學(xué)“壺天博士后計(jì)劃”，獲國(guó)家自然科學(xué)基金博士后面上項(xiàng)目、國(guó)家資助博士后研究人員計(jì)劃和國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目、10人次研究生國(guó)家獎(jiǎng)學(xué)金。

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【摘 要】

肝臟缺血再灌注損傷（HIRI）是肝臟手術(shù)和肝移植后不可避免的并發(fā)癥。胞嘧啶單磷酸激酶2（CMPK2）在調(diào)控線粒體DNA（mtDNA）合成和氧化還原代謝中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，但其在HIRI中的作用及其潛在治療手段仍不明確。我們通過整合測(cè)序技術(shù)和多種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在HIRI的起始階段，過量的酰基輔酶A（Acly-CoA）促進(jìn)了�；o酶A硫酯酶2依賴的線粒體游離脂肪酸的合成和積累，從而促進(jìn)了肝細(xì)胞中活性氧（ROS）的產(chǎn)生。在氧化應(yīng)激反應(yīng)中，CMPK2刺激mtDNA的合成和氧化，mtDNA進(jìn)一步通過開放的線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）釋放，并以自分泌的方式激活TLR9-MYD88-NF- κB -IRF1信號(hào)通路。我們隨后證實(shí)，毛蕊花苷（ACT）在體內(nèi)外均能顯著保護(hù)CMPK2介導(dǎo)的氧化還原代謝，并能緩解缺血再灌注損傷（HIRI）。機(jī)制上，ACT抑制IRF1核轉(zhuǎn)位，從而抑制Cmpk2和Duox2的轉(zhuǎn)錄，防止活性氧（ROS）的產(chǎn)生和線粒體DNA（mtDNA）的泄漏。此外，ACT還能結(jié)合CMPK2并促進(jìn)其線粒體自噬依賴性的降解。值得注意的是，在肝細(xì)胞中特異性過表達(dá)CMPK2可阻斷ACT的治療作用。綜上所述，我們的研究結(jié)果表明CMPK2是HIRI中氧化還原失調(diào)的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素，并強(qiáng)調(diào)ACT作為一種多靶點(diǎn)治療藥物具有臨床轉(zhuǎn)化潛力。

01

研究背景及科學(xué)問題

肝臟缺血再灌注損傷（HIRI）是一種重要的病理生理過程，其特征是過度氧化應(yīng)激、代謝失衡和炎癥，發(fā)生在肝臟經(jīng)歷氧氣和營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足一段時(shí)間后，隨后血流恢復(fù)時(shí)[ 1 ]。它是多種臨床情況下不可避免的并發(fā)癥，例如肝切除或肝移植，并可能導(dǎo)致嚴(yán)重的后果，包括圍手術(shù)期全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能衰竭[ 2 ]。HIRI的發(fā)病機(jī)制通常包括兩個(gè)階段。在初始缺血階段，血流受限會(huì)誘發(fā)細(xì)胞代謝紊亂，導(dǎo)致活性氧（ROS）過度生成、線粒體膜電位（MMP）崩潰和肝毒性[ 3 ]。血液再灌注會(huì)通過誘導(dǎo)內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）的釋放，例如高遷移率族蛋白B1（HMGB1）或線粒體DNA（mtDNA），進(jìn)而激活Toll樣受體（TLRs） ，從而進(jìn)一步加劇氧化應(yīng)激和炎癥[ 4 ]。目前避免或減輕缺血再灌注損傷（HIRI）的臨床策略主要集中于縮短缺血時(shí)間、采用缺血預(yù)適應(yīng)或及時(shí)使用藥物干預(yù)。然而，現(xiàn)有的抗氧化劑和線粒體保護(hù)劑對(duì)HIRI的保護(hù)作用有限，這構(gòu)成了一個(gè)亟待解決的重大臨床挑戰(zhàn)。

線粒體及其相關(guān)的代謝過程同時(shí)影響著氧化應(yīng)激、代謝紊亂和炎癥反應(yīng)之間的復(fù)雜相互作用。我們最近發(fā)現(xiàn)，肝缺血再灌注損傷（HIRI）會(huì)引發(fā)三磷酸腺苷（ATP）合成的破壞、活性氧（ROS）的爆發(fā)性積累以及線粒體動(dòng)力學(xué)失衡，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞能量危機(jī)[ 5 ]。既往研究強(qiáng)調(diào)，在缺血期，線粒體功能障礙與脂質(zhì)代謝紊亂相關(guān)，且發(fā)生在HIRI的炎癥事件和細(xì)胞死亡之前[ 6 ] 。有趣的是，游離脂肪酸（FFA）誘導(dǎo)的脂質(zhì)沉積也會(huì)刺激肝細(xì)胞中ROS的爆發(fā)和氧化應(yīng)激，并對(duì)線粒體功能產(chǎn)生反向影響[ 7 ]。此外，脂質(zhì)-活性氧（ROS）積累和線粒體功能障礙協(xié)同加速線粒體DNA （mtDNA）的氧化和釋放[ 8 , 9 ] ，進(jìn)一步形成以脂質(zhì)代謝紊亂、線粒體氧化還原功能障礙和炎癥加劇為特征的惡性循環(huán)[ 10 , 11 ] 。因此，識(shí)別同時(shí)影響線粒體脂質(zhì)代謝和以mtDNA為中心的氧化應(yīng)激的關(guān)鍵通路，可能直接減輕與缺血再灌注損傷（HIRI）相關(guān)的損害。胞嘧啶單磷酸激酶2（CMPK2）主要定位于線粒體，是合成脫氧核苷三磷酸以調(diào)節(jié)mtDNA復(fù)制的限速酶[ 12 ]。據(jù)報(bào)道，敲低CMPK2可以減少mtDNA釋放到胞質(zhì)溶膠中[ 13 ]。最近有報(bào)道稱，CMPK2在代謝性肝病患者的肝臟中顯著上調(diào)。此外，肝細(xì)胞特異性敲除Cmpk2可顯著抑制炎癥和隨后的肝細(xì)胞焦亡[ 14 ]，但其在肝缺血再灌注損傷（HIRI）發(fā)展中的確切功能仍不明確。

許多天然產(chǎn)物因其廣泛的生物活性、較高的安全性以及長(zhǎng)期使用副作用極小而備受關(guān)注，有望為肝損傷相關(guān)炎癥（HIRI）的治療帶來新的希望。臨床前研究表明，白藜蘆醇、人參皂苷、姜黃素、丹酚酸以及三七總皂苷均具有抗氧化和抗炎作用，并能調(diào)節(jié)HIRI中的代謝紊亂，無(wú)論單獨(dú)使用還是與其他藥物聯(lián)合使用[ 15 , 16 ] 。毛蕊花苷（ACT）是一種廣泛存在于肉蓯蓉和地黃等傳統(tǒng)中藥中的苯丙素苷，因其對(duì)多種肝臟疾病的抗氧化、抗炎和抗凋亡特性而日益受到關(guān)注。我們之前的研究表明，ACT抑制了受損肝細(xì)胞來源的DAMPs的合成和向肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（LSECs）的轉(zhuǎn)移，從而逆轉(zhuǎn)了LSEC的衰老并改善了HIRI中的肝竇微環(huán)境[ 4 ]。此外，我們最近證實(shí)，ACT增強(qiáng)了poly(RC)結(jié)合蛋白2 (PCBP2)-系統(tǒng)Xc?的結(jié)合親和力，從而通過限制缺氧誘導(dǎo)因子1α (HIF-1α)和p300，限制了HIRI期間HMGB1誘導(dǎo)的肝細(xì)胞鐵死亡、M1巨噬細(xì)胞募集和免疫反應(yīng)[ 17 ]。盡管已初步觀察到 ACT 與肝細(xì)胞保護(hù)作用之間的關(guān)聯(lián)，但仍需進(jìn)一步證實(shí) CMPK2 在脂質(zhì)代謝異常、氧化應(yīng)激和 HIRI 發(fā)展中的確切功能，以及闡明 ACT 的具體作用方式。

本研究綜合運(yùn)用體內(nèi)HIRI小鼠模型、體內(nèi)肝細(xì)胞特異性Cmpk2過表達(dá)模型和體外缺氧復(fù)氧（HR）模型，結(jié)合全肝及單細(xì)胞RNA測(cè)序（RNA-Seq）和一系列分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，深入探究了ACT如何通過調(diào)控TLR9-干擾素調(diào)節(jié)因子1（IRF1）-CMPK2/雙氧化酶2（DUOX2）-線粒體DNA軸，改善氧化還原代謝，并阻斷HIRI中以CMPK2為中心的脂毒性-高氧化-炎癥惡性循環(huán)。本研究不僅為CMPK2在HIRI過程中線粒體脂質(zhì)代謝與氧化還原失調(diào)相互作用中的病理作用提供了新的見解，而且有助于ACT從實(shí)驗(yàn)室走向臨床應(yīng)用，成為預(yù)防HIRI的一種極具前景的新策略。

02

重要發(fā)現(xiàn)及亮點(diǎn)

ACT的抗HIRI作用與肝臟線粒體氧化還原代謝的調(diào)節(jié)密切相關(guān)

我們初步表明，ACT可通過修復(fù)以PCBP2為中心的肝細(xì)胞鐵死亡和減輕肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（LSEC）衰老來改善肝缺血再灌注損傷（HIRI），而這兩者都與細(xì)胞代謝紊亂和氧化還原反應(yīng)密切相關(guān)[ 4 , 17 ]。在此，我們進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，以進(jìn)一步研究ACT對(duì)肝臟線粒體脂質(zhì)代謝和氧化死亡模式的影響。如圖S1a所示，與血清轉(zhuǎn)氨酶升高相一致，HIRI顯著增加了炎癥浸潤(rùn)、肝竇充血、水腫和以肝細(xì)胞為中心的細(xì)胞凋亡，這由TUNEL試劑和肝細(xì)胞核因子4α（HNF-4α）的共染色面積增加所證實(shí)（圖1a和b；圖S1b - S1d）。值得注意的是，ACT顯著逆轉(zhuǎn)了肝臟中與缺血性損傷和肝細(xì)胞死亡相關(guān)的病理現(xiàn)象。接下來，我們對(duì)不同組別的肝臟以及從肝組織中分離的單細(xì)胞類型肝細(xì)胞進(jìn)行了RNA測(cè)序分析。利用這些不同的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行比較和相關(guān)性分析，從而篩選出核心靶點(diǎn)簇。如圖1c所示，HIRI組全肝中主要改變的功能注釋涉及ATP合成偶聯(lián)的電子傳遞、細(xì)胞凋亡過程和炎癥反應(yīng)，而ACT顯著逆轉(zhuǎn)了這些過程。有趣的是，我們還觀察到，�；o酶A（Acyl-CoA）代謝過程、DNA代謝過程、脂質(zhì)代謝過程以及線粒體細(xì)胞色素c的釋放和線粒體電子傳遞等類似的生物學(xué)過程在HIRI組中發(fā)生了顯著改變，但在ACT治療組中未發(fā)生改變（圖1d）。在對(duì)全肝和細(xì)胞水平的數(shù)據(jù)集進(jìn)行比較和分析后，我們發(fā)現(xiàn)共同的關(guān)鍵靶點(diǎn)主要是Cmpk2和髓系分化原初反應(yīng)蛋白88 ( Myd88 )（圖1c和d）。此外，我們進(jìn)行了圖1e的分析，并重點(diǎn)介紹了ACT逆轉(zhuǎn)HIRI的關(guān)鍵過程，這些過程涉及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解途徑、細(xì)胞凋亡執(zhí)行階段、脂肪酸氧化和氧化磷酸化。此外，通過對(duì)體內(nèi)和體外水平的RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行交叉分析，我們鑒定了主要包括線粒體、脂質(zhì)代謝過程和細(xì)胞凋亡過程在內(nèi)的最關(guān)鍵通路（圖1f） 。最后，我們對(duì)肝組織和肝細(xì)胞進(jìn)行了脂肪細(xì)胞分化相關(guān)蛋白（ADRP）染色，進(jìn)一步闡明了ACT主要通過重新平衡線粒體中的脂質(zhì)積累和氧化還原事件來干預(yù)脂質(zhì)代謝過程（補(bǔ)充圖S2a和S2b）。

圖1. ACT減輕了HIRI小鼠和HR刺激的肝細(xì)胞的肝損傷。(a) 不同組別的H&E染色代表性圖像（箭頭指示肝損傷區(qū)域，包括炎癥灶）。比例尺 = 100 μm。(b) 不同組別的HNF-4α和TUNEL免疫組化染色代表性圖像。比例尺 = 100 μm。(c) 和 (d) 分別為不同組別小鼠分離的全肝和原代肝細(xì)胞中關(guān)鍵差異表達(dá)基因（DEGs）的熱圖，紅色線條指示不同的基因簇。(e) 小鼠肝臟（上圖）和原代肝細(xì)胞（下圖）中HIRI組和HIRI+ACT組的基因集富集分析（GSEA）。(f) 以氣泡圖形式可視化的全肝和原代肝細(xì)胞差異表達(dá)基因的GO富集分析結(jié)果。

ACT影響由ACOT2控制的脂肪酸合成，并重塑線粒體氧化代謝

隨后，我們對(duì)原代肝細(xì)胞的RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行了熱圖分析，重點(diǎn)關(guān)注參與脂質(zhì)合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝的基因，特別是�；o酶A硫酯酶（ACOTs）家族的基因。圖2a展示了差異表達(dá)基因（DEGs）的層級(jí)聚類結(jié)果。在HIRI組中，我們檢測(cè)到Acot2顯著上調(diào)，Acot2是肝細(xì)胞中負(fù)責(zé)將�；o酶A水解為游離脂肪酸（FFA）的靶基因，而其他ACOTs家族成員則未見上調(diào)。與此一致的是，HIRI小鼠肝臟中ACOT2的表達(dá)及其與線粒體標(biāo)志物線粒體外膜20（TOM20）的共定位均增加，但在ACT治療后則逆轉(zhuǎn)（圖2b；補(bǔ)充圖S3a）。 AML12細(xì)胞中ACOT2的翻譯變化趨勢(shì)與小鼠肝臟中的變化趨勢(shì)相同（補(bǔ)充圖S3b）。由于ACOT2的強(qiáng)烈干預(yù)，HIRI手術(shù)后肝臟FFA含量顯著增加（圖2c ，上圖），更重要的是，其與小鼠肝臟中Acot2 mRNA表達(dá)的變化呈正相關(guān)（圖2d，上圖）。同時(shí)，ACT逆轉(zhuǎn)了HIRI手術(shù)引起的FFA積累，并打破了其與Acot2的正相關(guān)性。進(jìn)一步分析顯示，在HR損傷和ACT給藥下，肝細(xì)胞中FFA含量及其與Acot2 mRNA的相關(guān)性均呈現(xiàn)相似的趨勢(shì)（圖2c和d，下圖）。此外，F(xiàn)FA的積累通常會(huì)通過多種途徑導(dǎo)致線粒體ROS的過度產(chǎn)生。如圖2e和f所示；補(bǔ)充圖S3c顯示，ACT減輕了HR誘導(dǎo)的ROS積累和氧化應(yīng)激，其特征是DCFH-DA熒光面積和丙二醛（MDA）水平（脂質(zhì)過氧化的典型標(biāo)志物）降低，谷胱甘肽（GSH）和超氧化物歧化酶（SOD）水平（抗氧化能力的公認(rèn)指標(biāo)）升高。氧化反應(yīng)對(duì)于維持線粒體穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，它通過防止脂質(zhì)沉積和促進(jìn)呼吸作用產(chǎn)生能量來維持線粒體穩(wěn)態(tài)。圖2g展示了與脂肪酸合成相關(guān)的FFA生物過程基因，例如酰基輔酶A合成酶長(zhǎng)鏈家族成員1（Acsl1）、脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)和氧化相關(guān)基因，如肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1a（Cpt1a）和�；o酶A氧化酶1（Acox1）。值得注意的是，與β相關(guān)的基因發(fā)生了變化。β-氧化尤其顯著。與此一致的是，HIRI或HR誘導(dǎo)的線粒體中FA β-氧化相關(guān)基因的mRNA表達(dá)下調(diào)，在ACT給藥后顯著恢復(fù)（圖2h）。此外，ACT處理的AML12細(xì)胞表現(xiàn)出比HR組更優(yōu)的線粒體功能，表現(xiàn)為ATP水平升高以及線粒體復(fù)合物I和IV活性增強(qiáng)（圖2i）。這些結(jié)果表明，ACT通過降低ACOT2的表達(dá)來減少FFA的過度生成，并選擇性地重新激活A(yù)COX1以恢復(fù)氧化代謝，從而重塑線粒體的氧化還原平衡。

圖2. ACT抑制ACOT2表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體氧化代謝紊亂。(a) 原代肝細(xì)胞中線粒體代謝相關(guān)基因的熱圖。(b) 小鼠肝臟中TOM20 (594 nm)、ACOT2 (488 nm)和DAPI (405 nm)免疫熒光染色代表性圖像。比例尺 = 100 μm。(c) 小鼠肝臟和AML12細(xì)胞中游離脂肪酸(FFA)水平。(d) 小鼠肝臟和AML12細(xì)胞中FFA水平與Acot2基因表達(dá)的相關(guān)性分析。(e) AML12細(xì)胞中活性氧(ROS) (488 nm)和DAPI (405 nm)免疫熒光染色代表性圖像。比例尺 = 20 μm。(f) 小鼠肝臟中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)水平。(g) 原代肝細(xì)胞中脂肪酸β-氧化和�；o酶A代謝相關(guān)基因的熱圖。在小鼠肝臟和經(jīng)ACT處理的AML12細(xì)胞中， Cpt1a、 Acox1和Acsl1的mRNA水平以Hprt1進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。(i) AML12細(xì)胞中ATP水平以及線粒體復(fù)合物I和IV的活性。統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001，與對(duì)照組相比； # P < 0.05， ## P < 0.01， ### P < 0.001，與模型組相比（數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)n = 3，小鼠實(shí)驗(yàn) n = 6）。

ACT通過抑制CMPK2來阻止肝細(xì)胞中mtDNA的產(chǎn)生和釋放

氧化應(yīng)激不僅會(huì)引發(fā)線粒體功能障礙，還會(huì)刺激損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）的持續(xù)釋放。我們進(jìn)行了環(huán)狀網(wǎng)絡(luò)圖分析，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)差異表達(dá)基因（DEGs）都與核酸相關(guān)，包括Tlr9、Cmpk2和Irf1，它們主要影響HIRI組和HIRI+ACT組肝細(xì)胞中線粒體DNA（mtDNA）的識(shí)別、合成和調(diào)控（圖3a）。接下來，我們重點(diǎn)研究了mtDNA相關(guān)的氧化應(yīng)激和線粒體功能的變化。差異表達(dá)基因的火山圖顯示，參與活性氧（ROS）和mtDNA產(chǎn)生及響應(yīng)的基因，包括Cmpk2、Tlr2、Tlr9和Cxcl10，在HR損傷下顯著上調(diào)，但在ACT治療后則下調(diào)（圖3b）。在這些共同反映線粒體DNA（mtDNA）軸關(guān)鍵步驟的基因中，Cmpk2表現(xiàn)出最顯著且一致的 ACT 逆轉(zhuǎn)變化。在高活性氧（ROS）條件下，由于缺乏組蛋白保護(hù)且靠近氧化呼吸鏈，mtDNA 特別容易受到氧化損傷。這種脆弱性導(dǎo)致氧化型 mtDNA （ox-mtDNA）的產(chǎn)生增加[ 18 ]。隨后，通過 TOM20 與抗 DNA 或 8-OHdG 的共染色來可視化 mtDNA 和 ox-mtDNA 的含量。如圖3c和補(bǔ)充圖 S4a和S4b所示，與同源重組（HR）刺激相比，ACT 顯著降低了 mtDNA 和 ox-mtDNA 的含量。值得注意的是，在圖 3b中參與 mtDNA 相關(guān)生物學(xué)過程的各種差異表達(dá)基因（DEGs）中，我們發(fā)現(xiàn)Cmpk2與 mtDNA 合成的關(guān)聯(lián)最為密切。有趣的是，在HIRI或HR損傷后，全肝細(xì)胞和分離的線粒體中CMPK2蛋白水平顯著升高，而ACT干預(yù)可顯著降低其水平，尤其是在線粒體組分中（圖3d和e）。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）過度開放，是由電壓依賴性陰離子通道1（VDAC1）介導(dǎo)的，會(huì)導(dǎo)致線粒體腫脹、嵴破壞，最終導(dǎo)致膜破裂。本研究采用mPTP抑制劑環(huán)孢素A（CsA）、mPTP開放激活劑（包括羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙（FCCP，促進(jìn)MMP去極化）和ATP（刺激VDAC寡聚化））來檢測(cè)mPTP的開放狀態(tài)[ 19 ]。ACT抑制了VDAC1介導(dǎo)的mtDNA釋放和mPTP的異常開放，表現(xiàn)為抗DNA抗體與VDAC1共定位的下調(diào)，以及Calcein熒光強(qiáng)度的恢復(fù)（圖3f和g；補(bǔ)充圖S4c）。同樣，我們發(fā)現(xiàn)，在HIRI或HR損傷后，ACT顯著降低了血清和條件培養(yǎng)基中mtDNA的含量和釋放量（圖3；補(bǔ)充圖S4d ）。如圖3i和補(bǔ)充圖S4e所示，JC-1和TMRE染色結(jié)果表明，在HR處理的肝細(xì)胞中觀察到了由MMP異常引起的肝細(xì)胞死亡，而在ACT處理的肝細(xì)胞中未觀察到。

圖3. ACT通過抑制CMPK2抑制缺氧肝細(xì)胞中mtDNA的合成和釋放。(a) DAMP分子環(huán)狀網(wǎng)絡(luò)圖。(b) HIRI組和HIRI+ACT組原代肝細(xì)胞中差異表達(dá)基因(DEG)表達(dá)的火山圖。(c) AML12細(xì)胞中TOM20 (594 nm)、抗DNA (488 nm)、8-OHdG (488 nm)和DAPI (405 nm)免疫熒光染色代表性圖像。比例尺=20 μm。(d)、(e) 小鼠肝臟和AML12細(xì)胞中全細(xì)胞和線粒體中CMPK2的蛋白表達(dá)水平以β-肌動(dòng)蛋白或TOM20進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。(f) AML12細(xì)胞中VDAC1 (594 nm)、抗DNA (488 nm)和DAPI (405 nm)免疫熒光染色代表性圖像。比例尺 = 20 μm。(g) AML12 細(xì)胞中 Calcein AM (488 nm) 免疫熒光染色的代表性圖像。比例尺 = 20 μm。(h) 左圖：小鼠血清中 mtDNA 水平；右圖：AML12 細(xì)胞培養(yǎng)基中 mtDNA 水平。(i) AML12 細(xì)胞中 JC-1 分析的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果。統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001，與對(duì)照組相比； # P < 0.05， ## P < 0.01， ### P < 0.001，與模型組相比（數(shù)據(jù)以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤表示，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)n = 3，小鼠實(shí)驗(yàn) n = 6）。

缺氧通過TLR9-MYD88-NF -κB信號(hào)通路 觸發(fā)IRF1的激活和核轉(zhuǎn)位，而ACT可完全阻斷這一過程

基于肝細(xì)胞特異性RNA測(cè)序數(shù)據(jù)分析主要反應(yīng)受體譜后，我們預(yù)測(cè)，HR刺激后， TLR2等多種TLR表達(dá)顯著升高，而ACT干預(yù)后則降低。盡管HR組中TLR9和TLR7的表達(dá)水平并不高，但在ACT給藥后觀察到其表達(dá)顯著降低，尤其是TLR9基因的P值更高（圖4a）。值得注意的是，TLR9主要在內(nèi)體中表達(dá)，并因其對(duì)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外來源的mtDNA的反應(yīng)而聞名[ 20 ]。雖然目前尚無(wú)文獻(xiàn)表明TLR2可以直接響應(yīng)mtDNA，但它可能感知由mtDNA觸發(fā)的其他DAMPs [ 21 , 22 ]。 qPCR分析和多重免疫熒光染色均觀察到一致的結(jié)果，表明在HIRI小鼠肝臟和經(jīng)HR處理的肝細(xì)胞（以肝細(xì)胞標(biāo)志物HNF-4α或CK18標(biāo)記）中TLR2和TLR9表達(dá)上調(diào)；然而，給予ACT后，TLR2和TLR9表達(dá)下調(diào)（圖4b和c；補(bǔ)充圖S5a - S5c ）。如圖4d和補(bǔ)充圖S6a所示，CsA引起的mPTP關(guān)閉顯著降低了TLR2和TLR9的相對(duì)熒光強(qiáng)度，即使在HR條件下也是如此；而FCCP和ATP誘導(dǎo)的mPTP持續(xù)開放刺激了這兩種受體的表達(dá)，但ACT不再逆轉(zhuǎn)這種作用。除TLR3外，所有TLR均通過MyD88通路傳遞信號(hào)，并激活核因子-κB (NF- κB )轉(zhuǎn)錄因子，從而加劇肝臟炎癥[ 23 ]。HIRI組和HR組中TLR9、MyD88和p-NF-κB p65的蛋白水平均顯著升高，而ACT治療可降低這些蛋白水平（圖4e；補(bǔ)充圖S6b ）。ACT對(duì)體外TLR2表達(dá)的降低作用不顯著。接下來，為了進(jìn)一步確定哪些轉(zhuǎn)錄因子或下游基因受到NF- κB的影響，我們利用CHEA3數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行預(yù)測(cè)，最終發(fā)現(xiàn)了IRF1（圖4f）。最近有報(bào)道稱，NF- κB p65可與Irf1啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，從而激活其轉(zhuǎn)錄。[ 24 ]進(jìn)一步轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)，并作為轉(zhuǎn)錄因子激活下游基因網(wǎng)絡(luò)。如圖4g和補(bǔ)充圖S6c所示，與HR組相比，ACT顯著下調(diào)了IRF1的熒光表達(dá)和核定位。然而，在mPTP持續(xù)激活的情況下，這種ACT介導(dǎo)的限制性轉(zhuǎn)位效應(yīng)被完全抑制（圖4h；補(bǔ)充圖S6d）。

圖4. ACT通過調(diào)控TLR9-MYD88-NF- κB信號(hào)通路抑制IRF1的核轉(zhuǎn)位。(a) 原代肝細(xì)胞中TLR基因表達(dá)的三維圖。(b) 小鼠肝臟和(c) AML12細(xì)胞中TLR9 (647 nm)、TLR2 (594 nm)、HNF-4α (488 nm)、CK18 (488 nm)和DAPI (405 nm)免疫熒光染色代表性圖像。比例尺分別為100 μm和20 μm。(d) AML12細(xì)胞中TLR9 (647 nm)、TLR2 (594 nm)和DAPI (405 nm)免疫熒光染色代表性圖像。比例尺為20 μm。小鼠肝臟和AML12細(xì)胞中TLR9、TLR2、MYD88、p-NF-κB p65和NF-κB p65的蛋白表達(dá)水平以β-肌動(dòng)蛋白進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。(f) 篩選調(diào)控CMPK2基因的轉(zhuǎn)錄因子。(g)、(h) AML12細(xì)胞中IRF1 (488 nm)和DAPI (405 nm)免疫熒光染色代表性圖像。比例尺 = 20 μm。統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：*** P < 0.001，與對(duì)照組相比； # P < 0.05， ## P < 0.01， ### P < 0.001，與模型組相比（數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)n = 3，小鼠實(shí)驗(yàn) n = 6）。

ACT通過抑制IRF1來減少CMPK2的轉(zhuǎn)錄以及隨后的mtDNA合成和釋放

為了進(jìn)一步驗(yàn)證ACT是否通過抑制IRF1核轉(zhuǎn)位來影響線粒體損傷相關(guān)分子模式（mito-DAMPs）相關(guān)靶點(diǎn)的激活，我們將HIRI+ACT組與HIRI組（黃色陰影區(qū)域）的差異表達(dá)基因（DEGs）與ENCODE（綠色陰影區(qū)域）、GTRD（藍(lán)色陰影區(qū)域）和CHIP_Atlas（粉色陰影區(qū)域）數(shù)據(jù)庫(kù)中與IRF1下游靶點(diǎn)相關(guān)的基因信息整合在一起（圖5a）。我們重點(diǎn)關(guān)注四個(gè)基因集中191個(gè)基因的交集，這些基因集主要涵蓋線粒體DNA復(fù)制、細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)和炎癥反應(yīng)等領(lǐng)域。此外，我們還對(duì)這191個(gè)差異表達(dá)基因中的關(guān)鍵基因進(jìn)行了反向預(yù)測(cè)分析，結(jié)果表明IRF1是主要的潛在轉(zhuǎn)錄因子（圖5b）。結(jié)合上述兩種預(yù)測(cè)方法，我們篩選出表達(dá)倍數(shù)變化顯著的基因進(jìn)行進(jìn)一步研究，包括Cmpk2、Hmgb1和Duox2。在HIRI和HR組中，Cmpk2、Hmgb1和Duox2的mRNA表達(dá)均升高，但在小鼠肝臟和肝細(xì)胞中，ACT處理均可降低這些mRNA的表達(dá)（圖5c；補(bǔ)充圖S7a）。IRF1能夠感知來自TLR-MyD88-TRIF通路的信號(hào)，并與CMPK2的啟動(dòng)子結(jié)合，進(jìn)而誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄[ 25 ]。隨后，為了探究ACT是否通過IRF1影響CMPK2的轉(zhuǎn)錄，我們利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)網(wǎng)站JASPAR鑒定了IRF1在CMPK2上的靶位點(diǎn)（圖5d ）。此外，我們?cè)贏ML12細(xì)胞中進(jìn)行的ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，HR促進(jìn)了肝細(xì)胞中IRF1與Cmpk2啟動(dòng)子或外顯子2區(qū)域的結(jié)合，而ACT處理則顯著逆轉(zhuǎn)了這一過程（圖5e）。隨后，我們瞬時(shí)轉(zhuǎn)染靶向Cmpk2 的siRNA ，或處理純化的 CMPK2 蛋白，以驗(yàn)證 CMPK2 在觸發(fā) mtDNA 泄漏及其下游靶點(diǎn)后續(xù)變化中的不可或缺的作用。值得注意的是，Cmpk2的敲低與 ACT 具有協(xié)同作用，導(dǎo)致 mtDNA 含量降低（圖 5f；補(bǔ)充圖 S7b），抑制 Irf1 的核轉(zhuǎn)位（圖 5g；補(bǔ)充圖 S7c ），進(jìn)而影響Irf1和Hmgb1的轉(zhuǎn)錄（補(bǔ)充圖 S7d ）。此外，重組 CMPK2 蛋白有效拮抗了 ACT 對(duì) mtDNA-TLRs/NF- κB -IRF1 信號(hào)通路的治療作用（圖 5f）。和g；補(bǔ)充圖 S7b和S7c）。此外，SPR 檢測(cè)表明，ACT 能夠與 IRF1 蛋白結(jié)合（圖 5h），結(jié)合位點(diǎn)為：(TRP38 LYS39 HIS40 ALA41 ALA42 PRO74 LYS75 THR76 LYS78 ALA79 ARG82 MET85 ASN86 SER87 LEU88 PRO89 ILE91 GLU92 GLU93 VAL94 LYS95 GLN97 SER98 ARG99 ASN100 LYS101 SER103 SER104 ALA105 VAL106 ARG107)（圖 5i，Vina 評(píng)分 = -7.4），這可能影響 IRF1 與 CMPK2 啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合位置。

圖5. CMPK2抑制劑與ACT聯(lián)合用藥可協(xié)同降低線粒體DNA合成和IRF1的核轉(zhuǎn)位。(a) 原代肝細(xì)胞中IRF1潛在下游靶點(diǎn)的脈絡(luò)圖。(b) 主要潛在轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測(cè)分析。(c) AML12細(xì)胞中Cmpk2、 Hmgb1和Duox2的mRNA水平以Hprt1進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。(d) CMPK2的預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄序列。(e)通過ChIP分析檢測(cè)Cmpk2啟動(dòng)子和外顯子上的IRF1結(jié)合位點(diǎn)。(f) TOM20 (594 nm)、抗DNA (488 nm)、(g) IRF1 (488 nm)和DAPI (405 nm)免疫熒光染色代表性圖像，分別在用ACT、siCMPK2或重組CMPK2蛋白處理的AML12細(xì)胞中進(jìn)行。比例尺 = 20 μm。 （h）ACT與IRF1結(jié)合的SPR結(jié)果。（i）ACT與IRF1的分子對(duì)接結(jié)果。統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001，與對(duì)照組相比； # P < 0.05， ## P < 0.01， ### P < 0.001，與模型組相比（數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示， n = 3）。

抑制DUOX2或完全清除缺氧肝細(xì)胞分泌的mtDNA，可發(fā)揮與ACT類似的抗HIRI保護(hù)作用

由于DUOX2異常產(chǎn)生的ROS會(huì)加劇氧化應(yīng)激和肝細(xì)胞損傷，我們檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HR組中DUOX2和CK18的共定位增加，而ACT處理可逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象（圖6a；補(bǔ)充圖S8a）。我們使用生物預(yù)測(cè)網(wǎng)站JASPAR分析DUOX2是否為IRF1的潛在下游靶點(diǎn)，并預(yù)測(cè)了其靶點(diǎn)結(jié)合位點(diǎn)（圖6b ）。此外，我們?cè)贏ML12細(xì)胞中進(jìn)行的ChIP-qPCR結(jié)果表明，HR促進(jìn)了肝細(xì)胞中IRF1與Duox2啟動(dòng)子或外顯子1區(qū)域的結(jié)合，而ACT處理顯著逆轉(zhuǎn)了這一結(jié)合（圖6c）。為了進(jìn)一步證實(shí)DUOX2參與了AML12細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生增加及其導(dǎo)致的氧化還原損傷，我們通過轉(zhuǎn)染特異性序列的siRNA沉默了Duox2基因。靶向Duox2 的siRNA導(dǎo)致Duox2、Cmpk2、Hmgb1和Cxcl10的 mRNA 水平相應(yīng)降低（圖 6d），并且與接受 HR 處理的細(xì)胞相比，ROS 生成顯著減少（補(bǔ)充圖 S8b），這與 ACT 具有協(xié)同作用。正如預(yù)期的那樣，HR 損傷后，胞質(zhì)中釋放的氧化型線粒體 DNA (ox-mtDNA) 水平（圖 6e；補(bǔ)充圖 S8c）和 IRF1 的核轉(zhuǎn)位（圖 6f；補(bǔ)充圖 S8d）均增加，但 siDUOX2 與 ACT 聯(lián)合給藥可顯著逆轉(zhuǎn)這些變化。接下來，我們從不同肝細(xì)胞組的培養(yǎng)基中提取 mtDNA，并將純化的 mtDNA 濃縮，用于進(jìn)一步轉(zhuǎn)染到另一組肝細(xì)胞中。如圖 6g和6h所示，與 mtDNA-Con 組相比，mtDNA-HR 組中 TLR9 和 MYD88 的 mRNA 和蛋白水平上調(diào)，而 TLR2 的 mRNA 和蛋白水平未見上調(diào)。mtDNA-HR + ACT 可降低 TLR9 和 MYD88 的 mRNA 和蛋白水平，而 DNase I 干預(yù)則可完全阻斷 TLR2 和 MYD88 的 mRNA 和蛋白水平的上調(diào)。此外，值得注意的是，DNase I 可拮抗 mtDNA-HR 轉(zhuǎn)染引起的 IRF1 轉(zhuǎn)錄增加和核轉(zhuǎn)位，以及隨后 CMPK2 和 DUOX2 的表達(dá)（圖 6g、i、j；補(bǔ)充圖 S9a和S9b）。這些結(jié)果表明，氧化型線粒體 DNA (ox-mtDNA) 的生成和自分泌釋放可能是 IRF1 的下游因子，也是最終的氧化損傷驅(qū)動(dòng)力，同時(shí)也是 ACT 對(duì)抗 HIRI 保護(hù)機(jī)制的關(guān)鍵組成部分。

圖 6. DUOX2 抑制和 ACT 給藥協(xié)同降低了線粒體 DNA (mtDNA) 的生成和氧化，這對(duì)于 TLR-IRF1 通路的激活至關(guān)重要。(a) AML12 細(xì)胞中 CK18 (594 nm)、DUOX2 (488 nm) 和 DAPI (405 nm) 免疫熒光染色的代表性圖像。比例尺 = 20 μm。(b) Duox2的預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄序列。(c) 通過 ChIP 分析檢測(cè)Duox2啟動(dòng)子和外顯子上的 IRF1 結(jié)合位點(diǎn)AML12 細(xì)胞中Duox2、 Hmgb1、 Cmpk2和Cxcl10的 mRNA 水平以Hprt1進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化圖 (e) 和 (f) 分別展示了經(jīng)siDuox2和 ACT 處理的 AML12 細(xì)胞中 TOM20 (594 nm) 和 8-OHdG (488 nm) 以及 IRF1 (488 nm) 和 DAPI (405 nm) 的免疫熒光染色代表性圖像。比例尺 = 20 μm。(g)將不同組別分離的純化 mtDNA 轉(zhuǎn)染到 AML12 細(xì)胞中，并以Hprt1進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，檢測(cè)Tlr9、 Tlr2、 Myd88和Irf1的 mRNA 水平。(h) 將 AML12 細(xì)胞中 TLR9、TLR2 和 MYD88 的蛋白表達(dá)水平以β-肌動(dòng)蛋白進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。圖 (i) 和 (j) 分別展示了 AML12 細(xì)胞中 IRF1 (488 nm)、CMPK2 (594 nm)、DUOX2 (488 nm) 和 DAPI (405 nm) 的免疫熒光染色代表性圖像。比例尺 = 20 μm。統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001，與對(duì)照組相比； # P < 0.05， ## P < 0.01， ### P < 0.001，與 HR 或 mtDNA HR組相比（數(shù)據(jù)以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤表示， n = 3）。

ACT 與 CMPK2 結(jié)合，并促進(jìn)線粒體自噬依賴性的 CMPK2 降解

為了進(jìn)一步探究ACT介導(dǎo)CMPK2降解的具體機(jī)制，我們首先在AML12細(xì)胞中應(yīng)用DARTS和CETSA實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)ACT能夠提高CMPK2的熱穩(wěn)定性并抑制蛋白酶對(duì)CMPK2的水解，提示ACT與CMPK2之間可能存在直接結(jié)合（圖7a和b；補(bǔ)充圖S10a）。分子對(duì)接的相互作用分析預(yù)測(cè)ACT與CMPK2具有很強(qiáng)的結(jié)合親和力（補(bǔ)充圖S10b）。為了進(jìn)一步證實(shí)ACT與CMPK2的相互作用，我們采用SPR和MST技術(shù)，確定CMPK2是ACT的直接靶點(diǎn)（圖7c和d；補(bǔ)充圖S10和S10d）。接下來，環(huán)己酰亞胺 (CHX) 追蹤實(shí)驗(yàn)表明，ACT 處理后 CMPK2 蛋白水平的降解得到促進(jìn)（圖 7e；補(bǔ)充圖 S10e）。蛋白質(zhì)穩(wěn)定性主要受多種蛋白質(zhì)降解途徑的影響，包括泛素-蛋白酶體途徑和自噬溶酶體途徑。為此，我們分別用 MG132 和巴弗洛霉素 A1 (BafA1) 處理 AML12 細(xì)胞以抑制蛋白酶體和溶酶體的活性，發(fā)現(xiàn) BafA1（而非 MG132）能有效導(dǎo)致 ACT 存在下 CMPK2 的積累（補(bǔ)充圖 S11a）。隨后，我們使用溶酶體特異性熒光探針 Lyso-Tracker 定量分析溶酶體的生物合成，并檢測(cè) CTSB（組織蛋白酶 B，一種主要的溶酶體水解酶）的活性以確定溶酶體的功能。如圖7f和7g以及補(bǔ)充圖S11b和S11c所示，在HR條件下，ACT處理可增強(qiáng)Lyso-Tracker的紅色熒光強(qiáng)度，而BafA1可逆轉(zhuǎn)這一效應(yīng)。同時(shí)，ACT促進(jìn)了HR組中成熟CTSB水平的升高，但BafA1阻斷了ACT誘導(dǎo)的pro-CTSB向成熟CTSB的轉(zhuǎn)化。此外，我們發(fā)現(xiàn)HR+ACT組中CMPK2與溶酶體相關(guān)膜蛋白1（LAMP1）的共定位程度更高，并證實(shí)ACT促進(jìn)了CMPK2與溶酶體的融合降解，而BafA1可逆轉(zhuǎn)這一過程（圖7h；補(bǔ)充圖S11d）。

圖7. ACT通過激活線粒體自噬 直接與CMPK2結(jié)合并誘導(dǎo)其降解。(a) CETSA和(b) DARTS檢測(cè)。(c) SPR結(jié)果和(d) MST分析ACT與CMPK2的結(jié)合。(e) AML12細(xì)胞CHX追蹤實(shí)驗(yàn)中CMPK2的蛋白表達(dá)以β-肌動(dòng)蛋白進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。(f) AML12細(xì)胞中Lyso-Tracker (594 nm)和DAPI (405 nm)免疫熒光染色代表性圖像。比例尺 = 20 μm。(g) AML12細(xì)胞中前體和成熟CTSB的蛋白表達(dá)以β-肌動(dòng)蛋白進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。(h)、(i) AML12細(xì)胞中CMPK2 (488 nm)、LAMP-1 (594 nm)、LC3 (594 nm)和DAPI (405 nm)免疫熒光染色代表性圖像。比例尺 = 20 μm。（j）AML12 細(xì)胞線粒體的代表性透射電鏡圖像。比例尺 = 20 μm。AML12 細(xì)胞中（k）PARKIN、LC3-I、LC3-II 和（l）CMPK2 的蛋白表達(dá)量以β -ACTIN 進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001，與相應(yīng)對(duì)照組相比； # P < 0.05， ## P < 0.01， ### P < 0.001，與 HR 組相比。 $ $ $ 與 HR + ACT M + Mdivi-1 組相比， P < 0.001 （數(shù)據(jù)以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，n = 3）。

溶酶體介導(dǎo)的降解過程主要包括非選擇性自噬和針對(duì)不同底物的選擇性自噬，例如P62依賴性泛素化蛋白、P62依賴性受損線粒體（稱為線粒體自噬）以及通過泛素化作用降解入侵微生物[ 26 ]。ACT給藥后LC3/CMPK2的熒光比值上調(diào)，但分別被自噬抑制劑SAR405（抑制液泡蛋白分選34）和3-MA（抑制III類磷脂酰肌醇3-激酶）抑制（圖7i；補(bǔ)充圖S11e）。與CHX+ACT組相比，CHX+ACT+SAR405組或3-MA組中CMPK2的水平顯著升高（補(bǔ)充圖S11f）。接下來，我們?cè)噲D探究是哪種自噬-溶酶體通路負(fù)責(zé)CMPK2的降解。透射電鏡（TEM）結(jié)果顯示，與HR組相比，ACT處理后的AML12細(xì)胞中形成了含有受損線粒體的自噬體（圖7j）。隨后，與HR組相比，ACT處理后PARKIN、LC3、PINK1和P62的蛋白水平顯著升高，而P62的蛋白水平則降低（圖7k；補(bǔ)充圖S11g）。值得注意的是，小鼠肝臟中線粒體自噬標(biāo)志物如PARKIN和PINK1的蛋白表達(dá)變化趨勢(shì)與AML12細(xì)胞中的趨勢(shì)一致（補(bǔ)充圖S11h）。STX17、SNAP29和VAMP8構(gòu)成SNARE蛋白復(fù)合物，該復(fù)合物在自噬體與溶酶體的融合過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。值得注意的是，與STX17和SNAP29相比，VAMP8的表達(dá)水平發(fā)生了顯著變化（補(bǔ)充圖S12a）。隨后，我們?cè)O(shè)計(jì)了三種不同的VAMP8小干擾RNA（siRNA）用于敲低VAMP8，并篩選出最有效的VAMP8 siRNA用于進(jìn)一步的CMPK2降解實(shí)驗(yàn)（補(bǔ)充圖S12b）。補(bǔ)充圖S12c顯示，敲低VAMP8抑制了ACT促進(jìn)CMPK2降解的作用。此外，我們用線粒體自噬激動(dòng)劑（CCCP）或抑制劑（Mdivi-1）處理AML12細(xì)胞，并在HR損傷條件下檢測(cè)ACT處理后CMPK2表達(dá)的變化。Mdivi-1處理明顯減弱了HR+ACT組中CMPK2水平的下降趨勢(shì)，而CCCP處理則加劇了這種下降趨勢(shì)（圖7l）。同時(shí)，免疫沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)，ACT給藥后CMPK2與P62和K63的結(jié)合均減少（補(bǔ)充圖S12d）。以上結(jié)果表明，ACT通過促進(jìn)線粒體自噬促進(jìn)肝細(xì)胞中CMPK2的降解，但不影響泛素-蛋白酶體降解途徑。

肝細(xì)胞特異性CMPK2過表達(dá)可直接抵消ACT的抗HIRI保護(hù)作用

為了進(jìn)一步證實(shí)CMPK2介導(dǎo)的肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝損傷在缺血再灌注損傷（HIRI）中的作用，以及這種損傷是否為ACT治療所特有，我們?cè)贖IRI手術(shù)和ACT預(yù)處理前，通過尾靜脈成功注射了攜帶CMPK2并經(jīng)ZsGreen熒光素標(biāo)記的AAV8病毒至小鼠體內(nèi)（圖8a；補(bǔ)充圖S13a）。肝功能指標(biāo)（血清AST和ALT）以及脂質(zhì)含量（血清FFA和總膽固醇[TC]）表明，肝細(xì)胞中CMPK2的過表達(dá)加劇了肝臟缺氧損傷和脂質(zhì)代謝異常，即使給予ACT也無(wú)法緩解（圖8b和c；補(bǔ)充圖S13b）。同時(shí)，CMPK2過表達(dá)肝臟的組織學(xué)檢查和TUNEL/HNF-4α共染色顯示，存在明顯的廣泛炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和肝細(xì)胞壞死，ACT干預(yù)后這些病變有所改善（圖8d和e）。此外，注射攜帶CMPK2的AAV8病毒并接受ACT治療后，肝臟中游離脂肪酸（FFA）水平降低（圖8f）。為了進(jìn)一步研究CMPK2過表達(dá)對(duì)肝臟脂質(zhì)代謝的刺激作用，我們分析了不同組中氧化應(yīng)激標(biāo)志物（包括ROS、MDA和GSH）的變化。如圖8g；補(bǔ)充圖S13c和S13d所示，HIRI+AAV CMPK2組中DCFH-DA熒光染色和MDA水平均顯著升高，而GSH含量降低，ACT干預(yù)后GSH含量變化不大。值得注意的是，與HIRI + AAV CMPK2組相比，ACT抑制了mtDNA向血清中的分泌（圖8h）。這些結(jié)果表明，肝細(xì)胞中CMPK的爆發(fā)性增加直接刺激mtDNA的產(chǎn)生，同時(shí)影響由FFA過度氧化引起的ROS積累。此外，我們驗(yàn)證了各組中參與CMPK2中心信號(hào)通路的幾個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)的表達(dá)變化。在HIRI + AAV CMPK2組中，CMPK2、TLR9、MYD88、p-NF- κB和IRF1的表達(dá)均顯著升高，而HMGB1、TLR2、ACOT2和DUOX2的表達(dá)則無(wú)顯著變化；但在小鼠肝臟中預(yù)先給予ACT后，這些靶點(diǎn)的表達(dá)幾乎沒有變化（圖8i和j；補(bǔ)充圖S13e和S13f） 。綜上所述，雖然ACT可以直接結(jié)合并抑制肝臟中CMPK2的表達(dá)，但它無(wú)法抵抗外源性CMPK2刺激引起的不良反應(yīng)以及在HIRI條件下隨之發(fā)生的脂質(zhì)代謝紊亂。

圖8. 肝細(xì)胞特異性過表達(dá)CMPK2顯著阻斷了ACT對(duì)小鼠肝臟的抗HIRI作用。(a) 小鼠肝臟中ZsGreen (488 nm)和DAPI (405 nm)免疫熒光染色代表性圖像。比例尺 = 100 μm。(b) 不同組小鼠血清中ALT水平；(c) 不同組小鼠血清中FFA水平。(d) 使用Image J軟件對(duì)H&E染色代表性圖像進(jìn)行定量分析。比例尺 = 100 μm。(e) 小鼠肝臟中TUNEL (594 nm)、HNF-4α (488 nm)和DAPI (405 nm)免疫熒光染色代表性圖像。比例尺 = 100 μm。(f) 不同組小鼠肝臟中FFA水平。(g) 小鼠肝臟中ROS (488 nm)和DAPI (405 nm)免疫熒光染色代表性圖像。比例尺 = 100 μm。（h）不同組別血清中線粒體DNA（mtDNA）水平。（i）小鼠肝臟中CMPK2、 Tlr9、 Myd88、 Irf1和Duox2的mRNA水平以Hprt1進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。（j）小鼠肝臟中CMPK2、MYD88、p-NF- κB和IRF1的蛋白表達(dá)以β-肌動(dòng)蛋白進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001，與假手術(shù)+AAV ev組比較。 $ $ " role="presentation"> $ $ P < 0.01， $ $ $ " role="presentation"> $ $ $ 與 HIRI + AAV CMPK2組相比， P < 0.001 （數(shù)據(jù)以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，n = 6）。

03

展 望

我們之前的研究表明，在減輕肝缺血再灌注損傷（HIRI）的過程中，及時(shí)阻斷肝細(xì)胞的氧化還原損傷和線粒體功能障礙至關(guān)重要[ 17 ]。此外，如果肝細(xì)胞的脂毒性和死亡過程不能立即停止，將會(huì)進(jìn)一步擾亂整個(gè)肝臟的代謝穩(wěn)態(tài)，并引發(fā)更嚴(yán)重的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[ 27 , 28 ]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)HIRI期間肝細(xì)胞中線粒體ACOT2的異常升高促進(jìn)了乙酰輔酶A合成游離脂肪酸（FFA），進(jìn)而刺激了以活性氧（ROS）增加為特征的氧化還原失衡（圖1和圖2）。對(duì)HIRI全肝組織和肝細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析表明，CMPK2表達(dá)顯著上調(diào)，且與線粒體功能障礙和疾病進(jìn)展呈正相關(guān)。重要的是，在ROS刺激的氧化環(huán)境下，CMPK2進(jìn)一步促進(jìn)了典型損傷相關(guān)分子模式（DAMP）——線粒體DNA（mtDNA）的氧化和合成，并通過肝細(xì)胞中線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）的開放刺激其分泌（圖3）。基于細(xì)胞的自分泌實(shí)驗(yàn)證實(shí)，從氧化肝細(xì)胞中純化的mtDNA通過激活低氧化狀態(tài)肝細(xì)胞中的TLR9-MYD88-NF- κB -IRF1信號(hào)通路，刺激了Cmpk2和Duox2的轉(zhuǎn)錄（圖4和圖5）。從機(jī)制上講，ACT與IRF1結(jié)合，抑制其核轉(zhuǎn)位以及下游靶基因的表達(dá)和功能，特別是抑制CMPK2刺激的mtDNA合成，同時(shí)降低DUOX2產(chǎn)生的ROS水平，從而改善HIRI或HR引起的病理現(xiàn)象（圖6）。此外，圖7表明，ACT促進(jìn)CMPK2的翻譯降解是通過線粒體自噬而非其他溶酶體或泛素介導(dǎo)的降解途徑實(shí)現(xiàn)的。相反，肝細(xì)胞特異性Cmpk2過表達(dá)直接抵消了ACT在體內(nèi)的抗HIRI保護(hù)作用（圖8）。

脂肪酸是細(xì)胞膜的重要組成部分，也是重要的能量底物，直接影響線粒體功能的穩(wěn)態(tài)。然而，脂肪酸在肝臟（尤其是肝細(xì)胞）中的積累會(huì)導(dǎo)致活性氧（ROS）過度產(chǎn)生和多種細(xì)胞死亡方式[ 29 ]。本研究發(fā)現(xiàn)，在缺血再灌注損傷（HIRI）期間，線粒體ACOT2（而非其他ACOT家族成員）異常升高，且與游離脂肪酸（FFA）水平呈正相關(guān)，而ACT可顯著降低FFA水平。有趣的是，在缺氧條件下，ACOT2介導(dǎo)的FFA積累并未增強(qiáng)脂肪酸β-氧化；相反，它加劇了ROS的產(chǎn)生（圖2）。高濃度的FFA誘導(dǎo)線粒體解偶聯(lián)呼吸，導(dǎo)致質(zhì)子重入而ATP無(wú)法生成，進(jìn)而抑制呼吸鏈[ 30 , 31 ]。進(jìn)一步研究表明，該機(jī)制可能涉及游離脂肪酸（FFA）作為輔助因子增強(qiáng)腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)位酶2（ACOT2）的質(zhì)子通透性，從而加速線粒體呼吸的解偶聯(lián)和線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）的開放。這會(huì)加劇線粒體活性氧（ROS）產(chǎn)生的紊亂，形成脂毒性-高氧化-炎癥的惡性循環(huán)[ 32 ]。給予ACT后，ACOX1的誘導(dǎo)和CMPK2的下調(diào)協(xié)同恢復(fù)了正常的FFA氧化和整個(gè)線粒體功能。此外，它還導(dǎo)致FFA生成減少，部分原因歸因于ACOT2水平的降低。然而，在HIRI下CMPK2和ACOT2靶點(diǎn)的損傷優(yōu)先性和相互作用模式，以及潛在的藥物靶點(diǎn)，仍需進(jìn)一步研究。

CMPK2是線粒體內(nèi)氧化型mtDNA片段生成所必需的。當(dāng)FEN1切割ox-mtDNA后，其片段通過線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）釋放到細(xì)胞質(zhì)中，激活NLRP3-cGAS-STING-IFN-γ通路并誘導(dǎo)炎癥[ 33 ] 。CMPK2還通過后續(xù)的ox-mtDNA-cGAS-STING信號(hào)通路直接促進(jìn)NLRP3炎癥小體的激活和巨噬細(xì)胞的募集，使其成為代謝性肝病進(jìn)展過程中的關(guān)鍵介質(zhì)[ 14 , 34 , 35 ]。ACT可降低HIRI或HR引起的CMPK2轉(zhuǎn)錄，并減少mtDNA合成，同時(shí)伴有TOM20和8-OHdG探針共染色強(qiáng)度的降低（圖3）。這些結(jié)果表明，ACT抑制缺氧肝細(xì)胞中線粒體DNA（mtDNA）的合成、氧化和釋放。有趣的是，在這些條件下，ACT對(duì)IFN-γ的表達(dá)影響不大，這表明它可能影響除cGAS-STING通路以外的mtDNA其他下游通路。由于其未甲基化的CpG基序，釋放的mtDNA也被報(bào)道可激活不同的分子信號(hào)通路，例如模式識(shí)別受體。值得注意的是，這種mtDNA依賴性激活表現(xiàn)出一定的敏感性，對(duì)TLR9具有特異性偏好，而TLR9反過來又通過NF-κB相關(guān)通路誘導(dǎo)一系列炎癥反應(yīng)[ 36 ] 。盡管在HIRI條件下TLR2和TLR9均上調(diào)，但ACT顯著降低了這兩種受體的表達(dá)，且對(duì)TLR9的影響更為顯著（圖4e）。此外，ACT抑制了TLR9-MYD88-NF- κB通路，降低了IRF1的核轉(zhuǎn)位及其后續(xù)的CMPK2轉(zhuǎn)錄表達(dá)以及mtDNA合成。值得注意的是，我們最近發(fā)現(xiàn)缺氧增強(qiáng)了HMGB1的釋放，HMGB1通過TLR2受體進(jìn)一步增強(qiáng)了IRF1的核轉(zhuǎn)位和功能，并伴有巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)[ 4 ] 。本研究進(jìn)一步證實(shí)了HIRI可能通過不同的DAMPs激活I(lǐng)RF1轉(zhuǎn)錄，以及ACT的協(xié)同抗氧化和抗炎保護(hù)作用（圖3、4、6）。更重要的是，給予ACT后，F(xiàn)FA過度積累、線粒體呼吸解偶聯(lián)和mPTP開放均得到逆轉(zhuǎn)，從而阻斷了mtDNA的外排-識(shí)別-攝取-激活循環(huán)，形成保護(hù)性環(huán)路。

盡管CMPK2在肝臟中的基礎(chǔ)表達(dá)水平相對(duì)較低，但我們觀察到在缺氧刺激下，肝細(xì)胞線粒體內(nèi)的CMPK2水平顯著升高，而ACT處理后，這種升高被顯著逆轉(zhuǎn)（圖3d，下半部分）。除了影響CMPK2的轉(zhuǎn)錄外，ACT還顯著降低了CMPK2蛋白的穩(wěn)定性（圖7e），但對(duì)其mRNA穩(wěn)定性沒有影響（數(shù)據(jù)未顯示）。此外，ACT與MG132或BafA1聯(lián)合處理后觀察到的差異表明，ACT通過自噬-溶酶體途徑降解CMPK2，這可能解釋了其促進(jìn)CMPK2與溶酶體標(biāo)志物L(fēng)AMP1共定位的原因（圖7h）。除了影響其他經(jīng)典的自噬-溶酶體降解途徑外，ACT還激活了線粒體自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，特別是PARKIN、PINK1、LC3和VAMP8。值得注意的是，即使在存在ACT的情況下，使用SAR405和3-MA抑制自噬早期階段、使用mdivi-1抑制線粒體自噬或沉默肝細(xì)胞中的VAMP8，均能顯著觀察到CMPK2的積累（圖7l；補(bǔ)充圖S11f、S12c ）。這些結(jié)果表明，ACT特異性地促進(jìn)P62依賴的CMPK2線粒體自噬降解，揭示了一種靶向降解CMPK的新機(jī)制。P62能夠?qū)⒎核鼗牡孜铮ɡ缡軗p線粒體上的PARKIN）與自噬體膜連接起來，這依賴于UBA結(jié)構(gòu)域內(nèi)的特定翻譯后修飾[ 37 ]。然而，我們初步發(fā)現(xiàn)ACT不影響TBK1和ULK1（負(fù)責(zé)P62在Ser349和Ser407位點(diǎn)的磷酸化）的激活，也不影響TIP60的表達(dá)（負(fù)責(zé)P62在K420位點(diǎn)的乙�；〝�(shù)據(jù)未顯示）。在通過SPR和MST實(shí)驗(yàn)證實(shí)ACT可以與CPMK2結(jié)合后，我們還預(yù)測(cè)了潛在的特異性結(jié)合位點(diǎn)（GLY10、GLY11、PRO12、GLY13、ALA14、GLY15、LYS16、GLY17、THR18、HIS31、SER33、ALA34和GLY35）。 ACT 是否通過與受損線粒體中積累的 CMPK2 結(jié)合，幫助 P62 執(zhí)行 PARKIN 依賴的線粒體外膜泛素化和隨后的自噬，以及這一過程是否與 CMPK2 上的特定結(jié)構(gòu)域有關(guān)，值得進(jìn)一步研究。

【Citation】:Luo R, Yang Y, Che X, et al. Acteoside mitigates hepatic ischemia-reperfusion injury by targeting CMPK2-intervened redox metabolism[J]. Targetome, 2026, 2(2).

【貢獻(xiàn)】★★★★★

綜上所述，我們的研究強(qiáng)調(diào)了 CMPK2 驅(qū)動(dòng)的異常氧化還原代謝在 HIRI 發(fā)病機(jī)制中的重要性，并突出了其作為新型治療靶點(diǎn)與天然生物活性化合物（如 ACT）聯(lián)合干預(yù)的潛力。

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