除靶基因自身序列因素外，DNA甲基化等表觀修飾也嚴(yán)重制約著靶基因編輯效率。DNA甲基化遍在于植物基因組中，與基因表達(dá)、染色質(zhì)重塑等重要的生物學(xué)過程相關(guān)，通常在胞嘧啶第5位加上甲基化修飾（5mC）【1】。近年來，基因編輯技術(shù)極大地促進(jìn)了基礎(chǔ)和應(yīng)用生物學(xué)研究。其中，II型細(xì)菌CRISPR系統(tǒng)CRISPR-Cas9和轉(zhuǎn)錄因子樣效應(yīng)核酸酶（TALEN）在真核生物中的應(yīng)用最為廣泛。然而，特定位點(diǎn)的甲基化修飾抑制了基因編輯效率，甚至在某些高甲基化位點(diǎn)難以實(shí)現(xiàn)有效編輯【2】，給研究者造成困擾。研究表明，TALEN與DNA靶序列的識別機(jī)制完全不同于CRISPR-Cas9，其對異染色質(zhì)的結(jié)合和編輯效率優(yōu)于CRISPR-Cas9【3】。能否利用TALEN的上述優(yōu)勢對編輯元件進(jìn)行改造，在植物中提高其識別甲基化位點(diǎn)的特異性進(jìn)而提升基因編輯效率具有重要意義。

近日，深圳市蘭科植物保護(hù)研究中心（蘭科中心）科研人員及其東京大學(xué)合作者在植物學(xué)國際知名期刊The Plant Journal在線發(fā)表了題為Using ngTALEN to improve genome editing efficiency on targets containing 5-methylcytosines的研究論文【4】，開發(fā)了利用ngTALEN核酸酶提高DNA甲基化靶位點(diǎn)基因編輯效率的有效方法。

研究人員首先結(jié)合單堿基水平甲基化數(shù)據(jù)，選擇開花調(diào)控相關(guān)Flowering wageningen (FWA) 為靶標(biāo)基因，針對啟動子雙串聯(lián)重復(fù)區(qū)和基因區(qū)甲基化位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)3個靶位點(diǎn)（圖A）。相應(yīng)靶向區(qū)域在野生型植物中高度甲基化，而在表觀突變體fwa中為去甲基化狀態(tài)。然后，通過獲得CRISPR-Cas9、TALEN、ngTALEN的轉(zhuǎn)基因材料，在重疊編輯窗口、較長時間跨度中考察甲基化對靶基因編輯效率的影響及編輯事件的可遺傳性和穩(wěn)定性。研究結(jié)果顯示，各編輯器在fwa表觀突變體背景下的基因編輯效率顯著高于野生型對照，表明甲基化狀態(tài)抑制基因編輯。與CRISPR-Cas9和TALEN相比，ngTALEN可有效提升甲基化啟動子和基因區(qū)的編輯效率（圖B）。這可能與基因編輯元件的蛋白表達(dá)水平無直接聯(lián)系，因?yàn)楸M管CRISPR-Cas9在甲基化位點(diǎn)的編輯效率相對較低，其表達(dá)水平卻高出TALEN和ngTALEN表達(dá)水平6倍以上（圖C）。通過對約1000個單株進(jìn)行測序?qū)Ρ确治霰砻?，甲基化抑制CRISPR-Cas9和TALEN基因編輯效率（圖D），TALEN較CRISPR-Cas9有明顯優(yōu)勢，而ngTALEN對高甲基化位點(diǎn)的編輯效率為最優(yōu)。因此，該研究開發(fā)了應(yīng)對基因組DNA高甲基化位點(diǎn)的基因編輯工具，為難以編輯位點(diǎn)突變提供了實(shí)用工具。

值得注意的是，雖然該研究證明啟動子區(qū)和基因區(qū)甲基化均可抑制基因編輯，并利用ngTALEN有效提高了DNA甲基化位點(diǎn)的編輯效率，但ngTALEN對基因組中普遍存在的其他復(fù)雜表觀修飾如組蛋白甲基化和乙?；任稽c(diǎn)的編輯作用有限。因此，下一步利用通用型RVD來識別胞嘧啶C和甲基化胞嘧啶5mC，結(jié)合對異染色質(zhì)可及性的調(diào)控，可望大幅提升基因編輯元件對復(fù)雜表觀修飾位點(diǎn)的基因編輯效率。

ngTALEN提升DNA甲基化位點(diǎn)編輯效率。A: 野生型Col-0和fwa-d表觀突變體背景下的FWA位點(diǎn)甲基化對比分析模式圖。B: 編輯效率對比分析。C: 基因編輯器表達(dá)水平對比分析。D. 測序結(jié)果匯總對比分析。

深圳市蘭科植物保護(hù)研究中心副研究員王志才為該論文第一作者，王志才和東京大學(xué)有村慎一教授為論文共同通訊作者。該研究得到了國家留學(xué)基金委員會訪問學(xué)者項(xiàng)目的支持。

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[4] Wang Zhicai, Tamura Yoshiko, Hashimoto Masaru, Nakazato Issei, Yamaguchi-Nishimura Asuka, Arimura Shin-ichi. Using ngTALEN to improve genome editing efficiency on targets containing 5-methylcytosines. Plant J (2026)126, e70826.

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/tpj.70826