近日，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)聯(lián)合崖州灣國家實(shí)驗(yàn)室等單位在Molecular Therapy期刊上發(fā)表最新研究成果。崖州灣國家實(shí)驗(yàn)室趙書紅教授、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)李新云教授和謝勝松教授為該論文的共同通訊作者。

該研究獲得一種新型Cas12a變體——PcuCas12a MAX（亦稱Gs12-7MAX），展現(xiàn)出優(yōu)異的基因組編輯性能。研究團(tuán)隊(duì)還鑒定出四種具有不同單鏈DNA反式切割活性的Cas12a變體。研究團(tuán)隊(duì)從海量微生物宏基因組數(shù)據(jù)中成功識別出多個此前未被表征的Cas12a家族新成員。通過系統(tǒng)篩選出21種蛋白結(jié)構(gòu)保守但氨基酸序列高度分化的候選蛋白，并系統(tǒng)評估其順式與反式切割活性。

高保真PcuCas12a MAX，可實(shí)現(xiàn)多物種高效精準(zhǔn)基因組編輯。通過比較順式切割活性，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)PcuCas12a在候選蛋白中具有最高的核酸內(nèi)切酶活性。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合結(jié)構(gòu)預(yù)測指導(dǎo)的蛋白質(zhì)工程化改造，成功構(gòu)建了高保真變體PcuCas12a MAX。活性評估結(jié)果顯示，PcuCas12a MAX在HEK293T細(xì)胞中的平均編輯效率與已知高活性變體AsCas12a Ultra相當(dāng)，而GUIDE-Seq全基因組脫靶分析進(jìn)一步表明，其編輯特異性顯著優(yōu)于后者。

研究重點(diǎn)評估了PcuCas12a MAX的跨物種基因組編輯能力。在小鼠模型中，針對Tyr基因的胚胎顯微注射高效獲得了白化表型F0代小鼠，驗(yàn)證了該工具在制備基因編輯動物模型中的高效性。

反式切割活性特異的Cas12a新變體，助力實(shí)現(xiàn)CRISPR多重核酸檢測。通過比較反式切割活性，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)LcoCas12a、FcaCas12a、EsoCas12a和Mac2Cas12a四種新型Cas12a同源物，在與工程化改造的CRISPR RNA配對后，展現(xiàn)出獨(dú)特的單鏈DNA反式切割特征。