蛋白質(zhì)是生命活動的執(zhí)行者，對其進行快速、準確的微觀解析，是生物技術(shù)領(lǐng)域面臨的重要挑戰(zhàn)，而多肽作為蛋白質(zhì)的重要組成單元，其高效檢測與分析更是蛋白研究的核心環(huán)節(jié)。近年來，基于納米孔技術(shù)的多肽與蛋白質(zhì)表征被視為最具潛力的下一代蛋白解析方案之一。然而，樣品制備難、分子操控復(fù)雜、信號解析不易等難題，一直制約著納米孔技術(shù)在多肽檢測領(lǐng)域的落地應(yīng)用。

針對上述技術(shù)瓶頸，華大生命科學(xué)研究院牽頭建設(shè)的基因組多維解析技術(shù)全國重點實驗室提出了一種新的解決方案，成功讓現(xiàn)有成熟的納米孔測序設(shè)備直接具備高通量多肽檢測的能力。

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具體來說，華大團隊從技術(shù)底層創(chuàng)新突破，設(shè)計出了一套適配現(xiàn)有納米孔測序芯片的全新解決方案。團隊以DNA作為牽引分子，借助解旋酶帶動多肽穩(wěn)定通過納米孔。同時，為實現(xiàn)多肽與DNA的快速高效偶聯(lián)，團隊采用修飾試劑對天然多肽末端進行疊氮化修飾，構(gòu)建出“核酸-多肽-核酸”的“三明治”文庫結(jié)構(gòu)（OPO 文庫）。這一文庫制備技術(shù)從天然多肽或蛋白質(zhì)起始，操作簡便高效，完美銜接現(xiàn)有納米孔測序設(shè)備，打破了樣品制備的瓶頸。

（左）OPO文庫制備流程示意圖：天然多肽經(jīng)疊氮化修飾后，與具有點擊化學(xué)修飾基團的DNA模板進行快速偶聯(lián)并純化獲得OPO文庫。（右）與現(xiàn)有納米孔設(shè)備適配的高通量多肽傳感體系示意圖。

本工作所使用的納米孔陣列芯片本身具備高通量數(shù)據(jù)產(chǎn)出能力，每小時可產(chǎn)出超10萬條有效檢測數(shù)據(jù)，為復(fù)雜的多肽傳感信號解析奠定了基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，源自同一種多肽的電流信號在呈現(xiàn)多樣性的同時，亦展現(xiàn)出高度一致的電流趨勢，這些信號的疊加圖構(gòu)成了一幅類似“密度矩陣”的指紋圖譜，揭示了多肽通過納米孔時的主要信號特征。

實驗表明，這一圖譜對多肽中氨基酸的電性、體積、極性等變化高度敏感，能夠檢測單氨基酸位點突變、位置異構(gòu)以及磷酸化等翻譯后修飾引起的細微改變。結(jié)合神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分類和密度矩陣過濾技術(shù)，研究團隊成功實現(xiàn)了對多種天然多肽的準確區(qū)分，解決了納米孔信號解析的關(guān)鍵難題。

（左上）以多肽Pep1為例，將2萬張多肽傳感信號疊加后，形成獨特的信號趨勢分布。（左下）通過算法模擬，將疊加信號的密度分布轉(zhuǎn)化為可量化的密度矩陣。（右）自動化算法處理流程。

基于該技術(shù)對相似多肽的高區(qū)分度，研究團隊進一步探索了其實際應(yīng)用潛力。在抗體研究領(lǐng)域，團隊發(fā)現(xiàn)OPO文庫的檢測數(shù)據(jù)產(chǎn)出比例與抗體親和力呈正相關(guān)。利用這一量化關(guān)系，研究團隊首次在納米孔測序設(shè)備上實現(xiàn)了抗原線性表位的鑒定及抗體親和力的半定量比較。

此外，在蛋白質(zhì)鑒定領(lǐng)域，針對三種人源蛋白開展的單盲實驗中，團隊通過蛋白質(zhì)酶切、文庫制備及肽段識別，實現(xiàn)了蛋白質(zhì)種類的準確判定，驗證了這一端到端方案的可靠性，為拓展納米孔測序儀的應(yīng)用領(lǐng)域奠定了實驗基礎(chǔ)。

（上）將覆蓋C肽全長的六條短肽制備成等比例混合OPO文庫，并用不同的抗體進行富集，通過富集比例差異，驗證了商業(yè)化抗體對應(yīng)的真實表位信息。（下）利用Anti-FLAG抗體對不同的FLAG突變體進行富集并構(gòu)建OPO文庫，通過富集比例評估了不同突變體的親和力強弱。

文章共同第一作者、華大生命科學(xué)研究院陳俊毅博士指出：“我們通過整合溫和高效的OPO文庫制備策略與自動化的數(shù)據(jù)分析流程，依托納米孔高通量傳感平臺，攻克了納米孔蛋白質(zhì)分析中通量低、天然樣品文庫制備難、信號解析復(fù)雜等行業(yè)難題。該技術(shù)不僅實現(xiàn)了對肽段的高精度區(qū)分，還可拓展應(yīng)用于抗體表位確定、親和力半定量評估、天然蛋白質(zhì)鑒定等場景，為蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了可靠的技術(shù)路徑?！?/p>

談及技術(shù)的未來發(fā)展，本文通訊作者、華大集團首席研究員、基因組多維解析技術(shù)全國重點實驗室主任徐訊表示：“未來，我們將繼續(xù)聚焦多肽直接檢測，從蛋白指紋圖譜分析起步，逐步搭建高通量親和力篩選平臺，并將其推進至活性多肽發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域；同時借助靶向富集策略，實現(xiàn)間接靶標檢測，借助納米孔設(shè)備的高靈敏度，將難以直接檢測的生物分子轉(zhuǎn)化為可讀信號，從而將納米孔檢測平臺打造成一個覆蓋更廣、靈敏度更高的多組學(xué)分析平臺，為生命科學(xué)研究、生物醫(yī)藥研發(fā)等領(lǐng)域提供更強大的技術(shù)支撐。”

基因組多維解析技術(shù)全國重點實驗室徐訊研究員、董宇亮研究員和華大集團劉斯奇研究員為本文共同通訊作者，王冀博士、陳俊毅博士、潘海林研究員、羅鳳琴和秦文兵博士為該論文共同第一作者。該工作獲得了科技部國家重點研發(fā)計劃、深圳市科創(chuàng)委和浙江省科技廳省重點研發(fā)計劃的資助，以及基因組多維解析技術(shù)全國重點實驗室和武漢華大生命科學(xué)研究院的大力支持。

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