近年來，人們對特種乳及其乳制品的需求持續(xù)增加，刺激了特種乳制品的發(fā)展。特種乳由于產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于牛乳，售價(jià)昂貴，在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)動下，市場上頻發(fā)低價(jià)乳摻入高價(jià)特種乳的現(xiàn)象，侵害了消費(fèi)者的合法權(quán)益、

目前已有許多不同的策略被用于乳制品摻假的檢測，基于DNA作為靶標(biāo)的分析檢測技術(shù)，可發(fā)展成為可信度較高的定性檢測方法，包括常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、多重PCR、實(shí)時(shí)PCR（PCR）、數(shù)字PCR（dPCR），其他與PCR相結(jié)合的技術(shù)等。其中real-time PCR方法是目前最重要的食品摻偽檢測方法之一，主要分為基于染料的SYBR Green real-time PCR和基于探針的

Taq

新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院的李威、孫國棟、楊潔*等人旨在建立一種以牛乳DNA為靶標(biāo)的real-time PCR檢測方法，通過設(shè)計(jì)特異性引物，并考察不同的特種乳及其乳制品中摻偽的牛乳DNA水平，以此對特種乳中摻假的牛乳進(jìn)行定性、定量檢測。同時(shí)，以駝乳以及駝乳制品為檢驗(yàn)對象，利用所建立的方法對20 種隨機(jī)購買的市售標(biāo)有純駱駝（

Camelus bactrianus

1 引物及探針特異性驗(yàn)證

1.1 SYBR Green real-time PCR引物特異性驗(yàn)證

采用SYBR Green real-time PCR，利用牛特異性引物（GHR）與通用引物（MSTN）分別與5 種樣品乳（駝乳、馬乳、羊乳、驢乳和牛乳）中提取出的DNA進(jìn)行了擴(kuò)增，同時(shí)建立無模板陰性對照。如圖1A所示，與其他4 種乳源物種DNA相比，牛特異性引物只在牛乳DNA中進(jìn)行了擴(kuò)增，反應(yīng)中沒有發(fā)生任何交叉污染或擴(kuò)增失敗，擴(kuò)增曲線的Ct值為19.191，3 次測試曲線高度重合，反應(yīng)較為靈敏；而選擇的通用引物分別在牛乳和其他特種乳基因組中均進(jìn)行了擴(kuò)增，反應(yīng)中同樣無交叉污染或擴(kuò)增失敗，牛乳、駝乳、驢乳、羊乳和馬乳DNA擴(kuò)增曲線的Ct值如圖1B所示。以上結(jié)果表明，所選取的通用引物可以將本實(shí)驗(yàn)中5 種乳源物種的基因組進(jìn)行擴(kuò)增，而所設(shè)計(jì)的牛特異性引物具有高度的特異性，能夠較好地區(qū)分牛與其他乳源物種，且不會對其他哺乳動物物種造成識別錯(cuò)誤，實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性良好。

1.2

Taq

采用TaqMan real-time PCR，使用牛特異性引物探針（Cyt B）分別與駝乳、驢乳、馬乳、羊乳和牛乳中提取的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)置無模板陰性對照，結(jié)果如圖2A所示，只擴(kuò)增出牛乳中提取的DNA，擴(kuò)增曲線的Ct值為19.205，與SYBR Green real-time PCR擴(kuò)增曲線的Ct值（19.191）接近，并且在駝乳、驢乳、馬乳、羊乳的基因組DNA和陰性對照組均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，說明該引物特異性同樣良好。而使用真核通用引物探針（18S RNA）分別與5 種乳中提取的基因組DNA進(jìn)行反應(yīng)擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)置無模板陰性對照。類似地，通用引物在5 種乳中均進(jìn)行了擴(kuò)增，牛乳、羊乳、驢乳、馬乳和駝乳的DNA擴(kuò)增曲線的Ct值如圖2B所示，采用TaqMan realtime PCR技術(shù)并使用牛特異性引物探針（Cyt B）同樣具有高度的特異性，能夠較好地區(qū)分牛與其他乳源物種。

2 方法靈敏性驗(yàn)證結(jié)果

2.1 SYBR Green real-time PCR方法靈敏性驗(yàn)證

如圖3A所示，牛特異性引物（GHR）最低可檢測到0.001 ng牛模板DNA，具有較高的靈敏度，以各稀釋質(zhì)量濃度DNA對應(yīng)的Ct值建立DNA質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到牛乳DNA質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝-3.629 5x+27.075，R2＝0.996 2，具有良好的線性度，定量范圍1 pg～100 ng（圖3B）。通用引物（MSTN）靈敏度結(jié)果如圖3C所示，通用引物最低可檢測到0.1 ng模板DNA。將所得各稀釋質(zhì)量濃度DNA對應(yīng)的Ct值建立DNA質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，此時(shí)牛乳DNA質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝-3.454 5x+30.21，R2＝0.997 2，具有良好的線性度，定量范圍10 pg～100 ng（圖3D）。已有研究報(bào)道，Guo Liang等以線粒體12S rRNA為生物標(biāo)識物設(shè)計(jì)引物，牛乳DNA的檢測靈敏度在原料乳中為0.001 ng，酸馬乳中為0.005 ng。Hai Xiao等以線粒體12S rRNA為生物標(biāo)識物設(shè)計(jì)牛源引物，靈敏度為0.1～50 pg。以上研究結(jié)果與本研究中檢測靈敏度存在差異，表明采用相同的方法但設(shè)計(jì)或選擇的引物不同同樣對檢測結(jié)果會造成重要影響；此外，提取DNA的質(zhì)量、PCR的擴(kuò)增效率以及是否采用了不同的處理方式，如熱處理等均會直接影響方法的檢測限及靈敏度；通常熱處理對DNA質(zhì)量有一定的影響，可能會造成PCR方法的靈敏性偏低。

2.2

Taq

采用TaqMan real-time PCR驗(yàn)證方法的靈敏性良好，如圖4A所示，牛特異性引物（Cyt B）可以擴(kuò)增到0.01 ng基因組DNA，將所得各稀釋質(zhì)量濃度DNA對應(yīng)的Ct值建立DNA質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，牛乳基因組DNA質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝-4.862 8x+28.262，R2＝0.996 9，線性良好，定量范圍為10 pg～100 ng，如圖4B所示。利用通用引物（18S RNA）進(jìn)行real-time PCR體系擴(kuò)增，可以擴(kuò)增到0.01 ng基因組DNA（圖4C），將所得各稀釋質(zhì)量濃度DNA對應(yīng)的Ct值建立DNA質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，DNA質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝-3.044 9x+30.851，R2＝0.978 2，定量范圍為10 pg～100 ng，如圖4D所示。在本研究中，與TaqMan real-time PCR方法相比，SYBR Green real-time PCR方法的靈敏性略高，這是由方法本身的特點(diǎn)所決定的。染料SYBR Green I能夠非特異性地結(jié)合DNA雙鏈，受環(huán)境影響較小，而TaqMan real-time PCR的熒光激發(fā)是利用Taq酶切割探針而實(shí)現(xiàn)的，酶活力受環(huán)境溫度、pH值等因素的影響較大，因此，TaqMan real-time PCR的靈敏性通常均會低于SYBR Green real-time PCR為正?，F(xiàn)象，這與前人的報(bào)道保持一致。

3 方法檢測限驗(yàn)證結(jié)果

3.1 SYBR Green real-time PCR方法檢測限驗(yàn)證

采用SYBR Green real-time PCR方法對不同特種乳的各摻假樣品DNA準(zhǔn)確定量至100 ng后進(jìn)行檢測。驢乳摻假樣品檢測結(jié)果如圖5所示，牛乳特異性real-time PCR體系在3 種處理方式的驢乳摻假樣品（原料乳、巴氏殺菌乳、噴霧干燥乳粉）中的檢測限均為0.1%，新鮮驢乳與經(jīng)過加工處理的驢乳中牛乳的摻偽檢出限相似，表明加工處理措施并未顯著降低該方法的靈敏度，且日間測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）低于2%，即儀器的日間精密性良好，實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性高。由于Ct值與DNA拷貝數(shù)呈負(fù)相關(guān)，因此Ct值與牛乳摻入量呈良好的線性響應(yīng)。采用公式建立校準(zhǔn)模型：其中新鮮驢乳中牛乳摻入量的擬合曲線為y＝-3.775 1x+29.671，R2＝0.995 1；巴氏殺菌驢乳中牛乳摻入量的擬合曲線為y＝-4.207 2x+32.206，R2＝0.996 2；驢乳粉中牛乳摻入量的擬合曲線為y＝-3.171 8x+32.019，R2＝0.996 8，線性均呈現(xiàn)良好。

駝乳摻假樣品檢測結(jié)果如圖6所示，牛乳特異性real-time PCR體系在鮮駝乳、巴氏殺菌駝乳摻假樣品中的檢測限為0.1%，然而，與鮮駝乳與巴氏殺菌駝乳相比，噴霧干燥駝乳粉中牛乳摻入量的檢測限略有升高，為1%，這表明乳粉制備過程中，噴霧干燥較高的溫度條件對檢測限產(chǎn)生了一定影響，導(dǎo)致檢測限升高，靈敏度下降。采用公式建立校準(zhǔn)模型：其中鮮駝乳中牛乳摻入量的擬合曲線為y＝-3.470 5x+31.119，R2＝0.997；巴氏殺菌駝乳中牛乳摻入量的擬合曲線為y＝-2.599 9x+33.087，R2＝0.993 9；駝乳粉中牛乳摻入量的擬合曲線為y＝-6.146x+37.332，R2＝0.994 3。

馬乳摻假樣品檢測結(jié)果如圖7所示，牛乳特異性realtime PCR體系在原料乳、巴氏殺菌乳摻假樣品中的檢測限均為0.1%，噴霧干燥乳粉的檢測限為1%，且日間的各個(gè)測定的數(shù)據(jù)RSD低于2%。其中原料馬乳中牛乳摻入量擬合曲線為y＝-3.684 7x+30.367，R2＝0.998 1；巴氏殺菌馬乳中牛乳摻入量擬合曲線為y＝-4.907 6x+31.688，R2＝0.993 7；馬乳粉中牛乳摻入量擬合曲線為y＝-3.927 5x+32.864，R2＝0.995 6。

羊乳摻假樣品檢測結(jié)果如圖8所示，羊乳特異性realtime PCR體系在3 種處理方式的摻假樣品中的檢測限均為0.1%，且日間的各個(gè)測定數(shù)據(jù)RSD低于2%。其中原料羊乳中牛乳摻入量擬合曲線為y＝-3.227 7x+31.686，R2＝0.992 3；巴氏殺菌羊乳中牛乳摻入量擬合曲線為y＝-2.442 4x+31.44，R2＝0.995 7；羊乳粉中牛乳摻入量擬合曲線為y＝-2.788 2x+27.16，R2＝0.990 1。

3.2

Taq

采用TaqMan real-time PCR方法對不同特種乳的各摻假樣品DNA準(zhǔn)確定量至100 ng后進(jìn)行檢測。驢乳摻假樣品檢測結(jié)果如圖9所示。牛乳特異性real-time PCR體系在原料乳、巴氏殺菌乳、噴霧干燥乳粉摻假樣品中的檢測限均為0.1%，日間RSD低于2%，同樣表明方法的日間精密性良好，實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性高。其中新鮮驢乳中牛乳摻入量擬合曲線為y＝-4.228x+28.915，R2＝0.994 1；巴氏殺菌驢乳中牛乳摻入量擬合曲線為y＝-4.899 4x+31.992，R2＝0.991 5；驢乳粉中牛乳摻入量擬合曲線為y＝-2.095 8x+29.089，R2＝0.990 5。

駝乳摻假樣品檢測結(jié)果如圖10所示，牛乳特異性real-time PCR體系在原料乳、巴氏殺菌乳摻假樣品中的檢測限與SYBR Green real-time PCR方法保持一致，也為0.1%，同樣觀察到噴霧干燥乳粉的檢測限略有升高，為1%，日間RSD低于2%。這表明，對于采用不同的檢測方法，實(shí)際樣品本身的性質(zhì)以及受熱處理的程度是重要的內(nèi)因，會直接影響樣品檢測限的變化。此時(shí)，鮮駝乳中牛乳摻入量擬合曲線為y＝-4.320 4x+29.698，R2＝0.997 5；巴氏殺菌駝乳中牛乳摻入量擬合曲線為y＝-6.009 7x+34.998，R2＝0.998 4；駝乳粉中牛乳摻入量擬合曲線為y＝-7.844 2x+36.26，R2＝0.999 5。

馬乳摻假樣品檢測結(jié)果如圖11所示，牛乳特異性real-time PCR體系在原料乳、巴氏殺菌乳粉摻假樣品中的檢測限為0.1%，噴霧干燥乳粉的檢測限為1%，且日間的各個(gè)測定的數(shù)據(jù)RSD低于2%。其中原料馬乳中牛乳摻入量擬合曲線為y＝-2.827x+28.632，R2＝0.997 2；巴氏殺菌馬乳中牛乳摻入量擬合曲線為y＝-4.359 4x+29.628，R2＝0.991 6；馬乳粉中牛乳摻入量擬合曲線為y＝-3.326 3x+31.533，R2＝0.995 6。

羊乳摻假樣品檢測結(jié)果如圖12所示，羊乳特異性real-time PCR體系在原料乳中的檢測限為0.1%，在巴氏殺菌乳、噴霧干燥乳粉摻假樣品中的檢測限均為1%。且日間測定的數(shù)據(jù)RSD低于2%。其中新鮮羊乳中牛乳摻入量擬合曲線為y＝-3.649x+27.733，R2＝0.992 4；巴氏殺菌羊乳中牛乳摻入量擬合曲線為y＝-3.047 5x+28.767，R2＝0.991 1；羊乳粉中牛乳摻入量擬合曲線為y＝-5.413 9x+33.57，R2＝0.990 0。

4 方法評價(jià)

根據(jù)本研究中的檢測限，分別選取牛乳摻假比例5%、25%和50%進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，對數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性、牛乳的預(yù)測摻假含量、回收率進(jìn)行評估，結(jié)果如表2所示，SYBR Green方法中牛乳摻假比例為5%、25%和50%樣品對應(yīng)Ct值日間精密性的RSD均低于2%，表明穩(wěn)定性強(qiáng)，駝乳、馬乳、驢乳和羊乳的5%、25%和50%摻偽比例實(shí)際測量的平均值分別為8.01%、25.07%和53.03%，總平均回收率為122%，但在對實(shí)際摻假比例為5%的樣本進(jìn)行檢測時(shí)，回收率達(dá)到了160%，說明SYBR Green的檢測方法在摻假比例較低時(shí)，準(zhǔn)確率偏低，檢測結(jié)果偏高，同時(shí)在實(shí)際摻假比例為50%時(shí)，回收率為106%，略大于105%，所以在摻假比例較高時(shí)，SYBR Green檢測方法的檢測結(jié)果也略高，整體來看，該方法的檢測結(jié)果要高于TaqMan方法。類似地，TaqMan方法的5%、25%和50%對應(yīng)Ct值日間精密性的RSD同樣低于2%，駝乳、馬乳、驢乳和羊乳5%、25%和50%的測量平均值為4.79%、23.54%和52.37%，總平均回收率為98.23%，穩(wěn)定性較強(qiáng)。

5 市售乳粉檢測

以駝乳為摻偽乳源，隨機(jī)購買了20 種商品標(biāo)識為純特種乳粉的市售樣本，按照對應(yīng)的牛乳摻入量標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行檢測，各一式3 份平行測定，通過計(jì)算獲得商業(yè)純?nèi)榉蹣颖局信Ｈ榉鄣暮?，檢測結(jié)果如表3所示。在20 種標(biāo)為全脂純?nèi)榉鄣纳虡I(yè)乳粉樣本中，有8 種乳粉中檢測到了牛源性成分，其中7 種乳粉的摻假比例超過了5%，表明這7 種乳粉中摻入了牛乳，這7 種駝乳粉為PCP1-1、PCP1-3、PCP1-5、PCP1-12、PCP1-15、PCP1-17、PCP1-20，為蓄意摻假乳粉，該方法的檢測結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)室以前建立的超高液相方法的檢測結(jié)果一致，這排除了檢測結(jié)果的假陽性和假陰性情況。結(jié)果表明，該方法可實(shí)際應(yīng)用于商業(yè)乳粉中摻假牛乳的篩查和檢測。

結(jié)論

本研究基于SYBR Green和TaqMan real-time PCR技術(shù)，以DNA為摻假標(biāo)志物，分別設(shè)計(jì)了基于兩種方法不同的特異性引物，并分別建立了定性定量檢測特種乳及其不同的熱加工產(chǎn)品中摻假牛乳的方法。DNA含量測定結(jié)果和Ct值之間呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。通過考察熱加工處理對摻假標(biāo)志物的影響，驗(yàn)證了兩種方法均具有可靠性，能夠準(zhǔn)確鑒別牛乳與特種乳成分，最低能檢測到1 pg牛乳DNA，定量范圍為1 pg～100 ng。方法的檢測限低至0.1%，檢測限范圍為0.1%～100%，可應(yīng)用于特種乳產(chǎn)品中新鮮乳、巴氏殺菌乳、乳粉中摻假牛乳的檢測。通過20 種標(biāo)為全脂純?nèi)榉鄣纳虡I(yè)乳粉樣本的檢測，驗(yàn)證其中7 個(gè)樣本被發(fā)現(xiàn)蓄意摻假牛乳。本研究開發(fā)的real-time PCR方法可作為一種快速、有效的檢測方法用于商業(yè)乳制品中牛乳摻偽的定性及定量分析，表現(xiàn)出高靈敏性和特異性，具有重要的理論參考和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

引文格式：

李威, 孫國棟, 鹿嘉榕, 等. 基于實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測特種乳中牛乳的摻偽[J]. 食品科學(xué), 2025, 46(6): 263-274. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20240727-273.

LI Wei, SUN Guodong, LU Jiarong, et al. Detection of bovine milk adulteration in non-novine milk using real-time polymerase chain reaction[J]. Food Science, 2025, 46(6): 263-274. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20240727-273.

實(shí)習(xí)編輯：安宏琳；責(zé)任編輯：張睿梅。點(diǎn)擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網(wǎng)

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