論文信息：

Q. Chen, Y. Ren, L. Hu, Y. Li, W. Liang, J. Wang, H. Gao, X. Wang, J. Li, Q. He, Y. Zhu, H. Hu, Q. Zhan, I. Gallouzi, J. Merzaban, D. Wang, Z. Du, X. Gu, Q. Gan, Intelligent Stain‐Free Histology on Structural Colorimetric Nanocavities, Advanced Science (2026) e14340.

論文鏈接：

https://doi.org/10.1002/advs.202514340.

研究背景

現(xiàn)代病理診斷離不開顯微鏡下對組織形態(tài)和顏色分布的判斷，但臨床金標(biāo)準(zhǔn)的蘇木精-伊紅染色不僅耗時費(fèi)力、成本高，還會因?yàn)槿疽簼舛炔▌雍驮噭┵|(zhì)量差異帶來一致性問題，而且診斷質(zhì)量在很大程度上依賴病理醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)與主觀判斷，這在數(shù)字化與個體化醫(yī)療越來越強(qiáng)調(diào)標(biāo)準(zhǔn)化、可復(fù)制的背景下就成了瓶頸，于是人們開始探索免染色的組織學(xué)成像來降低化學(xué)染色的成本與勞動強(qiáng)度，不過已有方案要么依賴昂貴復(fù)雜的中紅外或其他先進(jìn)顯微系統(tǒng)，要么像“虛擬染色”那樣需要大量高質(zhì)量訓(xùn)練數(shù)據(jù)和高端成像設(shè)備，最近出現(xiàn)的等離激元納米孔陣列載玻片雖然能用常見明場顯微鏡在無標(biāo)記切片上做出可用于判別的顏色對比，但其金屬薄膜納米圖案的制備依舊昂貴復(fù)雜，難以規(guī)�；M(jìn)入醫(yī)院常規(guī)流程，因此迫切需要一種更便宜、更易制造、又能直接融入現(xiàn)有臨床硬件并適合AI大規(guī)模數(shù)據(jù)采集的免染色組織學(xué)成像平臺 。本文 開發(fā)了干涉納米腔平面結(jié)構(gòu)，只需簡單的鍍膜便可實(shí)現(xiàn)各種顏色。將病理切片貼上去之后，免去了傳統(tǒng)染色步驟，可直接看到對比度清晰的細(xì)胞圖，大幅度減少制樣時間和花費(fèi)。和人工智能結(jié)合，可以做到快速準(zhǔn)確診斷。

研究內(nèi)容

病理診斷里最常見的套路還是看 H&E 染色切片，但這個流程既費(fèi)時費(fèi)力，又容易受試劑濃度、染色液質(zhì)量和操作一致性影響，結(jié)果還高度依賴病理醫(yī)生經(jīng)驗(yàn)，所以在追求標(biāo)準(zhǔn)化、數(shù)字化和更低成本的臨床環(huán)境里就顯得有點(diǎn)“老派又昂貴”了。過去十年出現(xiàn)過不少免染色思路，比如中紅外光譜化學(xué)成像、虛擬染色等，但往往需要更復(fù)雜昂貴的成像設(shè)備或海量訓(xùn)練數(shù)據(jù)；即便是納米光子芯片這種能在普通明場顯微鏡下做顏色對比的方案，也常被高成本的納米加工卡住了。作者因此把目標(biāo)定得很直接，用更便宜、更容易量產(chǎn)的平面納米腔結(jié)構(gòu)來做免染色組織學(xué)成像，并把后續(xù) AI 輔助篩查也一并納入同一條工作流里。

圖 1 基于硅基結(jié)構(gòu)色比色納米腔（NOS）載玻片的先進(jìn)無染色組織學(xué)分析。

(a) 智能組織學(xué)診斷示意圖，插圖為分層 NOS 載玻片結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)。

(b) 12 片 6 英寸 NOS 晶圓的光學(xué)照片，插圖展示干涉的光學(xué)機(jī)理。

(c) 對應(yīng)的反射光譜。右上角標(biāo)注了 Si?N? 層厚度（單位：nm）；下方部分給出了未覆蓋 Si?N? 層的硅晶圓反射情況。

(d、e) 玻璃載玻片上連續(xù)切取、名義厚度為 2 μm 的人結(jié)直腸上皮組織切片的對比顯微圖像： (d) 未進(jìn)行 H&E 染色；(e) 進(jìn)行了 H&E 染色。

(f–k) 不同顏色的 NOS 載玻片，其中頂層 Si?N? 厚度分別為： (f) 268 nm，(g) 243 nm，(h) 197 nm，(i) 158 nm，(j) 111 nm，(k) 85 nm。

所有圖像均使用 10× 物鏡（NA = 0.3）采集。圖 d–k 的比例尺：50 μm。

圖1主要在講“底座”到底是什么，以及它為什么能讓組織在不染色的情況下出現(xiàn)可讀的顏色對比。NOS 玻片本質(zhì)上就是在硅片上沉積一層納米級厚度的氮化硅，通過反射光的薄膜干涉產(chǎn)生結(jié)構(gòu)色，調(diào)一調(diào)氮化硅厚度就能得到一系列不同的底色與反射譜共振位置。然后作者把同一來源的結(jié)直腸上皮連續(xù)切片分別放在普通玻片和不同顏色的 NOS 玻片上做對比，能直觀看到 NOS 提供的顏色層次明顯更豐富，組織形態(tài)細(xì)節(jié)也更容易被“顏色差”帶出來，為后面定量分析和診斷鋪路。

圖 2 硅基結(jié)構(gòu)色比色納米腔（NOS）載玻片的分析。

(a) 健康與癌變結(jié)腸組織的折射率（RI）分布圖灰度圖像；灰度值與 RI 對應(yīng)。比例尺：10 μm。

(b) (a) 中組織 RI 值的統(tǒng)計(jì)分布。

(c) 在 CIE 色度圖上模擬得到：厚度 0.5 μm、折射率 n = 1.22–1.47 的材料在綠色 NOS 載玻片上的顏色位置變化。

(d) 在 CIE 色度圖上模擬得到：厚度 1 μm、折射率 n = 1.22–1.47 的材料在綠色 NOS 載玻片上的顏色位置變化。

(e) 人結(jié)直腸上皮組織切片的顯微圖像，標(biāo)出用于計(jì)算與分析的健康區(qū)域（藍(lán)框）和癌變區(qū)域（紅框）。玻璃載玻片上的所有圖像均由配備 20× 物鏡（NA = 0.75）的 Leica Aperio 掃描儀獲��；兩幅 NOS 圖像則使用 4× 物鏡（NA = 0.13）拍攝。比例尺：200 μm。

(f) (e) 中綠色 NOS 載玻片對應(yīng)區(qū)域的微區(qū)多光譜結(jié)果。

(g) 健康區(qū)域（藍(lán)色，上面板）與癌變區(qū)域（紅色，下面板）的 CIELAB 空間分布。

(h) 健康/癌變點(diǎn)云之間云點(diǎn)交并比（IoU）的小提琴圖（中間虛線表示中位數(shù)，上/下虛線表示四分位距 IQR；每組 n = 25）。采用雙側(cè)獨(dú)立樣本 t 檢驗(yàn)，玻璃 vs. NOS 的 p 值為 1.94×10?1?，H&E vs. NOS 的 p 值為 5.80×10?1?，二者在 α = 0.0001 水平上均具有顯著性。

圖2把“為什么會變色”這件事拆開來做定量解釋，并證明這種顏色差確實(shí)能更好地區(qū)分健康與癌變區(qū)域。作者先用光學(xué)衍射層析測了組織的折射率分布，發(fā)現(xiàn)健康與癌變上皮的折射率統(tǒng)計(jì)分布峰值有明顯差異；再結(jié)合 AFM 測到的真實(shí)厚度范圍，用傳輸矩陣法去模擬在不同折射率與厚度下 NOS 顏色在 CIE 色度圖上的漂移，說明很小的折射率或厚度變化就能帶來人眼可感知的顏色差。最后他們把實(shí)際圖像做成像素級 CIELAB 點(diǎn)云，用點(diǎn)云重疊度 IoU 來量化健康/癌變的顏色分離程度，結(jié)果顯示 NOS 上的點(diǎn)云分離優(yōu)于未染色玻片和傳統(tǒng) H&E。

圖 3 H&E 染色與 NOS 載玻片圖像中器官與組織病理連續(xù)切片的比較。

(a) 健康結(jié)直腸上皮，并給出放大的上皮細(xì)胞圖像。

(b) 結(jié)直腸腺癌及低分化腫瘤。

(c) 健康/癌浸潤的結(jié)直腸固有層。

(d) 健康/癌浸潤的結(jié)直腸肌層。

(e) 健康/癌變?nèi)橄伲ㄗ罅校�、肺（中列）與甲狀腺組織切片（右列）。

(f) 一例結(jié)直腸病例及其診斷結(jié)果。

玻璃載玻片上的所有圖像均由配備 20× 物鏡（NA = 0.75）的 Leica Aperio 掃描儀獲取；兩幅 NOS 圖像則使用 10× 物鏡（NA = 0.3）拍攝。圖 a–e 的比例尺：100 μm；圖 f 的比例尺：500 μm。

圖3是在回答“這東西是不是只對某一種組織好用”以及“病理醫(yī)生能不能直接拿它做判斷”。他們拿了多器官樣本做連續(xù)切片對照，在結(jié)直腸上皮、固有層、肌層等不同組織結(jié)構(gòu)里，NOS 圖像能復(fù)現(xiàn) H&E 下關(guān)鍵的腺體結(jié)構(gòu)、杯狀細(xì)胞缺失、細(xì)胞異型性、浸潤邊界等診斷要點(diǎn)，并把這種能力擴(kuò)展到乳腺、肺和甲狀腺等組織。更關(guān)鍵的是還做了盲法對比讀片，在一批結(jié)直腸病例里，用 NOS 圖像給出的區(qū)域劃分和 H&E 參考結(jié)果高度一致，用一致率和 Kappa 系數(shù)把“能用”這件事量化到了接近臨床可接受的水平。

圖 4 用于輔助評估的機(jī)器學(xué)習(xí)算法及其結(jié)果。

(a) AI 算法訓(xùn)練流程與輔助評估性能測試流程。

(b) 在測試數(shù)據(jù)集上測試得到的混淆矩陣。

(c) 模型的受試者工作特征（ROC）曲線，AUC 達(dá)到 0.987。

(d) 病理學(xué)家基于 H&E 染色圖像對一張結(jié)直腸組織切片給出的病理診斷結(jié)果。

(e) 在與 (d) 對應(yīng)的、NOS 載玻片上的連續(xù)無染色切片中，DenseNet121 模型給出的判別結(jié)果。比例尺：500 μm。

圖4把前面“可讀的結(jié)構(gòu)色”順手接到了 AI 上，展示了一個真正能跑起來的輔助評估流程。作者用 NOS 圖像切塊構(gòu)建結(jié)直腸健康/癌變上皮數(shù)據(jù)集，按病人級別劃分訓(xùn)練集和測試集，訓(xùn)練 DenseNet121 這類 CNN 做二分類，在測試集上給出高準(zhǔn)確率以及很高的 AUC，并用混淆矩陣和 ROC 曲線把模型性能說清楚。更貼近臨床的是他們把模型輸出做成整片區(qū)域的顏色標(biāo)注，去和病理醫(yī)生在 H&E 上圈出的病灶范圍對齊，結(jié)果顯示模型在大尺度區(qū)域分割上也能較好復(fù)現(xiàn)人工標(biāo)注，而且推理速度足夠快，適合做批量篩查和預(yù)分診。

結(jié)論與展望

文章提出一種可量產(chǎn)、低成本的免染色病理成像方案，在硅基底上沉積納米厚度氮化硅形成結(jié)構(gòu)色納米腔(NOS)載玻片，用普通明場顯微鏡即可把無標(biāo)記組織切片的微小厚度與折射率差異轉(zhuǎn)化為顯著顏色對比。作者通過光學(xué)衍射層析獲得折射率分布、用AFM測厚，并以傳輸矩陣法解釋不同組織在CIE色度空間的漂移，證明NOS能比常規(guī)未染色玻片與H&E在顏色點(diǎn)云上更好地區(qū)分健康與癌變區(qū)域。多器官連續(xù)切片對照顯示NOS圖像可呈現(xiàn)腺體結(jié)構(gòu)、杯狀細(xì)胞變化與浸潤邊界等關(guān)鍵病理特征，盲法讀片一致性接近H&E。進(jìn)一步構(gòu)建結(jié)直腸數(shù)據(jù)集訓(xùn)練CNN實(shí)現(xiàn)高AUC分類，并生成整片病灶熱圖，展示了可直接接入數(shù)字病理與AI篩查的臨床工作流。