撰文丨易

核孔復(fù)合體是鑲嵌在核膜上、介導(dǎo)大分子在細胞核與細胞質(zhì)之間選擇性運輸?shù)年P(guān)鍵通道。 其選擇性的核心，在于由核孔蛋白的FG（苯丙氨酸-甘氨酸）重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的動態(tài)運輸屏障。這些FG結(jié)構(gòu)域是無序的，像 “ 面條 ” 一樣從中心孔道的支架上延伸出來，既能阻擋非特異性大分子的自由擴散，又能通過與被稱為核轉(zhuǎn)運因子（Karyopherins,Kaps）的特異性轉(zhuǎn)運受體相互作用，高效地讓貨物分子通過。然而，這個屏障在分子層面究竟如何組織一直存在爭議。過去的研究主要基于體外模型，如FG水凝膠、高分子刷或生物分子凝聚體，但這些模型是靜態(tài)或宏觀的，無法完全反映在真實的、具有納米級對稱結(jié)構(gòu)的核孔內(nèi)FG結(jié)構(gòu)域的動態(tài)行為。此外，在電子顯微鏡下觀察到的、位于核孔中心的無定形結(jié)構(gòu) ——“ 中心栓 ” 的身份和功能也一直是個謎。因此，迫切需要一種能夠在接近生理時間和空間尺度上，直接觀察天然核孔內(nèi)FG屏障原位動態(tài)結(jié)構(gòu)的技術(shù)，以揭示其工作原理。

近日，瑞士巴塞爾大學(xué)Roderick Y. H. Lim和美國洛克菲勒大學(xué)Michael P. Rout在Nature Cell Biology期刊上發(fā)表題為Karyopherins remodel the dynamic organization of the nuclear pore complex transport barrier的研究論文，首次在毫秒級分辨率下，直接觀察并揭示了核孔復(fù)合體運輸屏障的動態(tài)本質(zhì)：核轉(zhuǎn)運因子與FG結(jié)構(gòu)域在核孔特有的對稱幾何約束下，共同形成了一個由中心動態(tài)“栓”和外圍波動“環(huán)”組成的納米級功能分區(qū)，從而高效調(diào)控核質(zhì)運輸。

本研究采用了一種名為高速原子力顯微鏡的前沿技術(shù)作為核心手段，并結(jié)合了多種體外和體內(nèi)方法進行交叉驗證。高速原子力顯微鏡能以約1毫秒的時間分辨率對生物樣本進行成像，其施加的探測力極低，非常適合研究脆弱、快速運動的FG結(jié)構(gòu)域，而不會造成明顯干擾。

首先，研究發(fā)現(xiàn)核孔中心的 “ 中心栓 ” 是一個高度動態(tài)的、由核轉(zhuǎn)運因子和FG結(jié)構(gòu)域共同組成的納米簇。在分離的野生型酵母核孔中，大部分都含有中心栓。高速原子力顯微鏡的實時成像顯示，這個栓并非固定不動的塞子，而是在孔道中心區(qū)域具有相當?shù)囊苿有?，可以探索孔道的寬度。更關(guān)鍵的是，觀察到周圍的FG結(jié)構(gòu)域像觸手一樣不斷從支架上波動，與中心栓發(fā)生碰撞、融合和分離。當部分核孔在長時間放置后中心栓 “ 消失 ” 時，其孔道內(nèi)FG結(jié)構(gòu)域的波動變得更為開放和隨機，失去了中心的凝聚力。質(zhì)譜分析證實，含有中心栓的核孔中穩(wěn)定結(jié)合了大約15-20個主要的核輸入因子Kap95分子，而在中心栓缺失的核孔中，超過一半的這種長期結(jié)合的Kap95及其接頭蛋白被替換或丟失。體外重建實驗完美地支持了這一關(guān)聯(lián)：當向中心栓缺失的核孔中添加外源的Kap95時，能夠以劑量依賴的方式重新形成中心栓樣結(jié)構(gòu)，并且其高度和垂直范圍與天然含有中心栓的核孔相似。這表明，中心栓的本質(zhì)是Kap與FG結(jié)構(gòu)域相互作用形成的一個動態(tài)、穩(wěn)定的復(fù)合物集群，它顯著增加了運輸屏障的垂直空間占據(jù)。

其次，研究深入探討了FG結(jié)構(gòu)域濃度和性質(zhì)對屏障功能的影響，發(fā)現(xiàn)過猶不及的精細平衡。通過分析兩種不同的核孔突變體，作者發(fā)現(xiàn)了有趣且關(guān)鍵的對比。一種是FG結(jié)構(gòu)域大量缺失的突變體，其FG重復(fù)濃度比野生型降低了約51%。另一種是通過基因工程延長了主要FG核孔蛋白Nsp1的結(jié)構(gòu)域，使其FG重復(fù)濃度比野生型高出約30%。在延長FG的突變核孔中，雖然Kap95在核孔處的富集量反而增加了，但活體運輸實驗卻表明，無論是通過Kap60-Kap95途徑的主動運輸，還是一個150 kDa大蛋白的被動擴散，其效率都顯著下降。與此同時，高速原子力顯微鏡觀察到這些突變核孔內(nèi)的FG結(jié)構(gòu)域形成了 “ 過度伸展、相互纏結(jié) ” 的篩網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其動態(tài)波動明顯變慢。這清晰地表明，過高的FG密度會導(dǎo)致屏障過緊，形成一個動力學(xué)上更為粘稠的環(huán)境，反而阻礙了高效運輸。這推翻了簡單的“FG越多屏障越強”的線性模型，揭示了核孔屏障的效能依賴于FG結(jié)構(gòu)域在開放性與選擇性之間的動態(tài)平衡。

再者，研究通過對比天然核孔與體外模型，有力地質(zhì)疑了傳統(tǒng)體外FG水凝膠作為核孔屏障模型的代表性。體外用Nup116FG等形成的選擇性水凝膠 ， 雖然能像核孔一樣允許Kap通過而排斥大的惰性蛋白，但其微觀結(jié)構(gòu)卻與天然核孔大相徑庭。高速原子力顯微鏡顯示，這些水凝膠表面粗糙，呈靜態(tài)的顆粒狀聚集，并且布滿了大小不一、形狀不規(guī)則（平均寬度約50納米）的孔洞，更像一塊充滿孔洞的海綿。更重要的是，其內(nèi)部存在長約1微米、直徑約25納米的淀粉樣纖維，結(jié)構(gòu)非常剛性。即使向其中添加Kap95，也觀察不到任何類似中心栓的動態(tài)結(jié)構(gòu)形成或局部的融化重塑，僅僅表現(xiàn)為水凝膠高度的增加。這說明體外自組裝形成的是熱力學(xué)穩(wěn)定的、具有淀粉樣纖維特征的靜態(tài)網(wǎng)絡(luò)，完全不同于在核孔幾何限制下形成的、依賴Kap動態(tài)重塑的納米級屏障。

最后， 為了驗證幾何約束的關(guān)鍵作用， 作者 構(gòu)建了被稱為 “ NuPODs ” 的人工納米通道，其大小、八邊形截面都模擬了真實的核孔，并在內(nèi)壁精確錨定了FG結(jié)構(gòu)域。實驗結(jié)果非常明確：在空的DNA支架中看不到動態(tài)行為；加入FG結(jié)構(gòu)域后，通道內(nèi)出現(xiàn)了類似無中心栓天然核孔的動態(tài)波動；而進一步添加Kap95后，奇跡般地在人工通道的中心誘導(dǎo)形成了一個可移動的、類似中心栓的納米簇，其高度和動態(tài)行為與Kap95濃度的關(guān)系，完美地復(fù)現(xiàn)了在真實核孔中觀察到的現(xiàn)象。這一實驗證明，核孔運輸屏障的動態(tài)組織并非FG結(jié)構(gòu)域和Kap相互作用的必然產(chǎn)物，而是必須發(fā)生在類似核孔（約50納米寬、旋轉(zhuǎn)對稱）的特定納米尺度幾何環(huán)境中才能涌現(xiàn)的特性。正是這種精確的物理架構(gòu)，使得FG結(jié)構(gòu)域的動態(tài)波動和Kap的結(jié)合能夠協(xié)同作用，自發(fā)形成一個動態(tài)分區(qū)的、功能性的納米機器。

綜上所述，本研究通過高速原子力顯微鏡等技術(shù)，清晰地揭示了核孔運輸屏障的動態(tài)組織機制，其核心發(fā)現(xiàn)是：核轉(zhuǎn)運因子通過對錨定在NPC通道內(nèi)、本質(zhì)無序的苯丙氨酸-甘氨酸（FG）結(jié)構(gòu)域的原位動態(tài)重塑，將屏障劃分為一個中心可移動的“栓”和周圍快速波動的“環(huán)”兩個功能區(qū)域，而這種結(jié)構(gòu)的形成強烈依賴于核孔對稱的納米幾何約束。這與體外FG結(jié)構(gòu)域組裝的許多宏觀性質(zhì)形成鮮明對比 。

https://doi.org/10.1038/s41556-025-01812-9

制版人： 十一

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