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Introduction

食源性致病菌廣泛存在于人們的日常生活當(dāng)中，威脅人類的生命健康，并給食品工業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。大腸桿菌O157:H7（E. coli O157:H7）被認(rèn)為是一個(gè)全球性的公共衛(wèi)生問題，會(huì)導(dǎo)致溶血性尿毒綜合癥和血性腹瀉，死亡率很高。因此新型食品可接觸抗菌材料的研發(fā)變得尤為重要。

金屬有機(jī)框架（MOFs）作為一類高度有序晶態(tài)多孔材料，表現(xiàn)出高比表面積、大孔徑和低密度等特點(diǎn)。MOFs獨(dú)特的結(jié)構(gòu)使其在功能應(yīng)用研究方面更具有多元性，通過預(yù)處理技術(shù)對(duì)MOFs進(jìn)行改性處理，可以改善MOFs自身的局限性，進(jìn)一步提高材料的性能。MOFs可用作金屬離子的儲(chǔ)存庫(kù)，其抗菌活性源于框架中陽離子形式的金屬，通過其框架結(jié)構(gòu)的生物降解而逐漸緩釋出具有抗菌活性的金屬離子，有效避免了高濃度金屬離子的毒性。MOFs作為一種新型抗菌材料，其抗菌活性的研究尚處于起步階段，在構(gòu)建安全、低成本、靈敏性的抗菌材料方面具有非常廣闊的應(yīng)用前景。

西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院?jiǎn)沃覈?guó)課題組利用兩步合成法構(gòu)建雙金屬中心復(fù)合抗菌劑體系，將抗菌性金屬離子Ag+包封入Cu-MOF中原位還原為Ag納米顆粒（NPs），合成出抗菌性增強(qiáng)的雙金屬中心復(fù)合抗菌劑Ag@Cu-MOF。同時(shí)，以E. coli O157:H7作為模型菌株，研究了Ag@Cu-MOF抗菌機(jī)制以及對(duì)生物被膜活性的影響，以豬肉為模型對(duì)Ag@Cu-MOF在E. coli O157:H7抑制方面的應(yīng)用前景進(jìn)行了探究。

圖1 Ag@Cu-MOF的制備及其對(duì)豬肉E. coli O157:H7的抑制機(jī)理研究

Result

Cu-MOF與Ag@Cu-MOF的表征

Cu-MOF的單晶結(jié)構(gòu)呈單斜P21/c空間群。Cu-MOF的一個(gè)不對(duì)稱單元還包含兩個(gè)五配位Cu2+離子、一個(gè)μ3-OH-陰離子、一個(gè)去質(zhì)子化tzia3-和一個(gè)配位DMA分子（圖2A）。由兩個(gè)μ3-OH-陰離子連接四個(gè)Cu原子，形成中心對(duì)稱的四核簇[Cu4(OH)2(COO)4(tetrazolate)2]。相鄰的四核簇由tzia3-配體延伸形成三維框架，沿（101）方向形成一維矩形通道（圖2B），形成(3,6)連接rtl拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)，點(diǎn)符號(hào)為(4·62)2(42·610·83)（圖2C）。PLATON計(jì)算Cu-MOF的有效孔隙率為32.2%。通過PXRD、TG、XPS、SEM、TEM、IR、元素分析和ICP-OES對(duì)Ag@Cu-MOF進(jìn)行進(jìn)一步表征（圖2D-I）。SEM圖顯示Cu-MOF和Ag@Cu-MOF均為規(guī)則條狀，寬度尺寸約為10 μm，Ag@Cu-MOF形貌并未發(fā)生明顯改變（圖3A-B）。Ag@Cu-MOF的SEM圖中沒有Ag NPs，而在其TEM圖中可見Ag NPs，尺寸約為10 nm（圖3C-E）。由此推測(cè)Ag NPs位于Cu-MOF的孔隙中而不是表面。Ag@Cu-MOF的TEM?EDS元素面掃描圖明顯證實(shí)了Ag NPs在Cu-MOF中均勻分布（圖3F-H）。

圖2 (A)Cu-MOF中Cu2+在四核簇中配位結(jié)構(gòu)示意圖；(B)Cu-MOF沿(101)方向的三維框架結(jié)構(gòu)圖；(C)Cu-MOF的rtl拓?fù)渚W(wǎng)；(D) PXRD圖譜；IR圖譜(E)和TGA曲線(F)；Ag@Cu-MOF(G)、Cu2p(H)和Ag3d (I)的XPS光譜

圖3 Cu-MOF(A)和Ag@Cu-MOF(B)的SEM圖；(C-E)Ag@Cu-MOF的TEM圖；(F)Ag@Cu-MOF和Cu-MOF的EDX譜圖；Ag@Cu-MOF(G)和Cu-MOF(H)元素面掃描圖

溶血活性和穩(wěn)定性評(píng)估

基于溶血試驗(yàn)對(duì)Ag@Cu-MOF和有機(jī)配體H3tzia的生物安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)。800 μg/mL H3tzia處理后，77.2%以上的紅細(xì)胞保持完整，說明高濃度時(shí)溶血活性很小。Ag@Cu-MOF的溶血率僅為0.07%，遠(yuǎn)低于允許極限(5%)。利用ICP-OES測(cè)定Ag@Cu-MOF中的Cu2+和Ag+，評(píng)價(jià)Ag@Cu-MOF和Cu-MOF的穩(wěn)定性（表1）。當(dāng)Ag+從Ag@Cu-MOF中釋放出來時(shí)，Ag@Cu-MOF水溶液(1 mg/mL)中的Cu2+幾乎是恒定的。Ag@Cu-MOF即使在800 μg/mL的高濃度下也不能引起溶血。上述結(jié)果表明Ag@Cu-MOF可能有利于Ag+的緩慢和控制釋放，溶血率可以忽略不計(jì)。

表1 Cu-MOF與Ag@Cu-MOF的ICP分析結(jié)果

Samples

Amount of Cu2+ (%)

Amount of Ag+ (%)

Cu-MOF

19.9

0

Ag@Cu-MOF

19.4

2.8

體外抗菌活性

H3tzia濃度為>1 mg/mL時(shí)不能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，Cu-MOF只有在高濃度時(shí)才具有抑菌活性。相比之下，Ag@Cu-MOF具有顯著的抑菌活性，MIC為200 μg/mL。生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)顯示Ag@Cu-MOF的抑菌效果隨著濃度的增加而增強(qiáng)（圖4A）。細(xì)菌細(xì)胞存活率與Ag@Cu-MOF濃度呈線性關(guān)系（圖4B）。結(jié)果表明Ag@Cu-MOF不僅能影響E. coli O157:H7的生長(zhǎng)還能誘導(dǎo)其死亡。

圖4 E. coli O157:H7生長(zhǎng)曲線與存活率

Discussion

細(xì)胞膜破損程度與Ag@Cu-MOF濃度增強(qiáng)呈正相關(guān)（圖5A），表明膜結(jié)構(gòu)明顯受損。通過掃描電鏡觀察了細(xì)胞形態(tài)的變化（圖5B）。對(duì)照組大腸桿菌O157:H7細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，呈棒狀，外觀光滑、細(xì)胞膜完整。當(dāng)Ag@Cu-MOF濃度增加到100和200 μg/mL時(shí)，部分細(xì)胞出現(xiàn)明顯的形態(tài)變化，細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、表面出現(xiàn)囊泡以及膜的全面破損，結(jié)果與SYTO 9/PI測(cè)定結(jié)果一致。此外，Ag@Cu-MOF在50、100、200和400 μg/mL濃度下，細(xì)胞內(nèi)ATP水平分別比對(duì)照細(xì)胞降低了39.2%、81.7%、87.7%和91.3%（圖5C）。Ag@Cu-MOF中含有Ag+和Cu2+，對(duì)E. coli O157:H7具有持續(xù)的抗菌作用。

圖5 E. coli O157:H7細(xì)胞膜完整性（A）、形態(tài)（B）和胞內(nèi)ATP（C）

Ag@Cu-MOF對(duì)E. coli O157:H7生物被膜作用機(jī)理

即使在25 μg/mL的低濃度下，Ag@Cu-MOF的存在也能對(duì)E. coli O157:H7生物被膜產(chǎn)生抑制和清除作用（圖6A和6B）。CLSM圖顯示Ag@Cu-MOF處理后生物被膜的完整性結(jié)構(gòu)被破壞（圖6C和6D），表明Ag@Cu-MOF可以穿透生物被膜基質(zhì)殺死E. coli O157:H7。

圖6 E. coli O157:H7生物被膜作用機(jī)理

對(duì)E. coli O157:H7生物被膜活性和細(xì)菌基因表達(dá)的影響

Ag@Cu-MOF明顯降低了E. coli O157:H7在生物被膜形成過程中的XTT轉(zhuǎn)化率（圖7A），表明Ag@Cu-MOF顯著降低了生物被膜細(xì)胞的生存能力。Ag@Cu-MOF處理后可顯著降低已形成的生物被膜細(xì)胞的代謝活性（圖7B）。Ag@Cu-MOF通過影響E. coli O157:H7的代謝能力以及抑制生物被膜相關(guān)基因的表達(dá)，從而發(fā)揮其抗生物被膜功能（圖7C）。

圖7 Ag@Cu-MOF對(duì)E. coliO157:H7生物被膜活性和細(xì)菌基因表達(dá)的影響

對(duì)豬肉儲(chǔ)存的影響

Ag@Cu-MOF對(duì)新鮮豬肉在4 ℃貯藏至12 天內(nèi)E. coli O157:H7的抑菌活性（圖8）。在豬肉樣品中發(fā)現(xiàn)Ag@Cu-MOF對(duì)E. coli O157:H7具有明顯生長(zhǎng)抑制作用。在冷藏12天期間，E. coli O157:H7細(xì)胞濃度從2.4 log CFU/cm2增加到3.7 log CFU/cm2。與對(duì)照組相比，Ag@Cu-MOF在1，2和4 μg/cm2時(shí)，細(xì)菌數(shù)量分別減少至3.6, 2.7和2.2 log CFU/cm2 。

圖8 豬肉模型中E. coli O157:H7的細(xì)菌數(shù)

Conclusion

本研究采用沉積還原法合成了Ag@Cu-MOF，具有良好生物相容性，并對(duì)E. coli O157:H7的滅活效果。Ag@Cu-MOF對(duì)E. coli O157:H7生物被膜形成具有明顯抑制和破壞作用。Ag@Cu-MOF可以顯著延緩E. coli O157:H7在新鮮豬肉中增長(zhǎng)繁殖，延長(zhǎng)新鮮肉的保質(zhì)期，可以作為控制食源性致病菌的重要技術(shù)手段。

作者簡(jiǎn)介

第一作者

楊棟博，男，西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院2019級(jí)本科生，食品科學(xué)與工程專業(yè)。

易靖，男，現(xiàn)為西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院碩士研究生，主要研究方向?yàn)槭称钒踩：ψR(shí)別控制。

通信作者

單忠國(guó)，男，西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院講師，研究生導(dǎo)師。主要研究食品安全危害識(shí)別控制，目前主持陜西省自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目、中國(guó)博士后科學(xué)基金面上項(xiàng)目、校企合作橫向課題項(xiàng)目、陜西省專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)和西北農(nóng)林科技大學(xué)博士科研啟動(dòng)項(xiàng)目，參與國(guó)家級(jí)和省部級(jí)科研基金項(xiàng)目4 項(xiàng)。以第一作者或通信作者發(fā)表文章10余篇，授權(quán)發(fā)明專利1 件。

王海華，女，西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院副教授，研究生導(dǎo)師。主要研究新型功能納米材料的設(shè)計(jì)合成及其在食品領(lǐng)域內(nèi)的安全檢測(cè)、可控識(shí)別及其抗菌機(jī)理。近五年主持國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目、陜西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目、陜西省基礎(chǔ)科學(xué)研究計(jì)劃青年項(xiàng)目、安徽省先進(jìn)纖維材料工程研究中心開放課題、陜西省專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)和西北農(nóng)林科技大學(xué)博士科研啟動(dòng)費(fèi)項(xiàng)目，參與多項(xiàng)國(guó)家級(jí)和省部級(jí)科研基金項(xiàng)目。以第一作者或通信作者發(fā)表文章20余篇，授權(quán)發(fā)明專利5件。

Novel silver nanoparticles loaded Cu-based metal-organic framework as a promising antimicrobial material for controlling Escherichia coli O157:H7 in pork

Dongbo Yang1, Jing Yi1, Xiaoya Li, Shuqi Zhang, Yiming Xiang, Xingxing Liu, Zhongguo Shan*, Haihua Wang*

College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China

1These authors contribute equally.

*Corresponding authors.

Abstract

DThe risk of infection following consumption of foodborne pathogens contaminated foods became a significant concern for human health and imposes great economic losses to food industry. Herein, Ag nanoparticles were integrated to Cu-based metal-organic framework (Cu-MOF) for antibacterial activity. The crystal structure, morphology and composition of the prepared composite Ag@Cu-MOF were confirmed by powder X-ray diffraction, thermogravimetric analysis, scanning electron microscope, transmission electron microscope, Fourier transform infrared spectroscopy, and X-ray photoelectron spectroscopy. Antibacterial assays revealed that Ag@Cu-MOF exhibited increased inhibitory activity against Escherichia coli O157:H7 in comparison to Cu-MOF. Ag@Cu-MOF treated bacterial cells displayed distinct morphological changes, a decreased ratio of live/dead cells, as well as a reduction of intracellular ATP. Antibiofilm studies demonstrated that Ag@Cu-MOF could dramatically inhibit biofilm formation and disrupt preformed biofilms by interfering the metabolic activity and decreasing the expression of biofilm-associated genes. Food contamination model illustrated that Ag@Cu-MOF significantly prevented the growth of E. coli O157:H7 in packed pork. This study sheds light on the potential of Ag@Cu-MOF as a promising antimicrobial material for preserving pork.

Reference:

YANG D B, YI J, LI X Y, et al. Novel silver nanoparticles loaded Cu-based metal-organic framework as a promising antimicrobial material for controlling Escherichia coli O157:H7 in pork[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(3): 9250060. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250060.

本文編譯內(nèi)容由作者提供

編輯：王佳紅；責(zé)任編輯：孫勇

封面圖片：圖蟲創(chuàng)意