一、定義與核心概念

固相合成（Solid-Phase Synthesis, SPS）是一種在固相載體上逐步構(gòu)建有機(jī)分子的化學(xué)合成方法，尤其以固相多肽合成（ solid phase peptide synthesis, SPPS）最為著名。其核心原理是將目標(biāo)分子的第一個(gè)單體（如氨基酸）通過化學(xué)鍵固定在不可溶的樹脂載體上，隨后依次添加后續(xù)單體，并通過重復(fù)的脫保護(hù)、偶聯(lián)和洗滌步驟完成鏈?zhǔn)窖由欤罱K切割樹脂得到目標(biāo)產(chǎn)物，此反應(yīng)極大的減小了多肽合成的難度。固相肽合成是肽合成化學(xué)的重要突破。其主要特點(diǎn)是無需純化中間產(chǎn)物，合成過程可以連續(xù)進(jìn)行，為多肽合成的自動化奠定了基礎(chǔ)。目前多肽的全自動合成基本上是固相合成。

二、發(fā)展脈絡(luò)

1、奠基階段 ----- 多肽合成研究已經(jīng)走過了一百多年的光輝歷程。1902年，Emil Fischer首先開始關(guān)注多肽合成，由于當(dāng)時(shí)在多肽合成方面的知識太少，進(jìn)展也相當(dāng)緩慢，直到1932年，Max Bergmann等人開始使用芐氧羰基(Z)來保護(hù)α-氨基，多肽合成才開始有了一定的發(fā)展。

到了20世紀(jì)50年代，有機(jī)化學(xué)家們合成了大量的生物活性多肽，包括催產(chǎn)素，胰島素等，同時(shí)在多肽合成方法以及氨基酸保護(hù)基上面也取得了不少成績，這為后來的固相合成方法的出現(xiàn)提供了實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。

1963年，Merrifield首次提出了固相多肽合成方法(SPPS)，這個(gè)在多肽化學(xué)上具有里程碑意義的合成方法，一出現(xiàn)就由于其合成方便，迅速，成為多肽合成的首選方法，而且?guī)砹硕嚯挠袡C(jī)合成上的一次革命，并成為了一支獨(dú)立的學(xué)科——固相有機(jī)合成(SPOS)。因此，Merrifield榮獲了1984年的諾貝爾化學(xué)獎。Merrifield經(jīng)過了反復(fù)的篩選，最終摒棄了芐氧羰基(Z)在固相上的使用，首先將叔丁氧羰基(BOC)用于保護(hù)α-氨基并在固相多肽合成上使用，同時(shí)，Merrifield在60年代末發(fā)明了第一臺多肽合成儀，并首次合成生物蛋白酶，核糖核酸酶(124個(gè)氨基酸)。

1972年，Lou Carpino首先將9-芴甲氧羰基(FMOC)用于保護(hù)α-氨基，其在堿性條件下可以迅速脫除，10min就可以反應(yīng)完全，而且由于其反應(yīng)條件溫和，迅速得到廣泛使用，以BOC和FMOC這兩種方法為基礎(chǔ)的各種肽自動合成儀也相繼出現(xiàn)和發(fā)展，并仍在不斷得到改造和完善。同時(shí)，固相合成樹脂，多肽縮合試劑以及氨基酸保護(hù)基，包括合成環(huán)肽的氨基酸正交保護(hù)上也取得了豐碩的成果。

2、技術(shù)革新---- Fmoc保護(hù)基的引入：1972年，路易斯·卡彭特（Louis Carpino）開發(fā)了Fmoc（9-芴甲氧羰基）保護(hù)策略。與Boc需強(qiáng)酸（如三氟乙酸，TFA）脫保護(hù)不同，F(xiàn)moc可通過溫和的堿性條件（如哌啶）脫除，減少副反應(yīng)，尤其適用于復(fù)雜多肽和自動化合成。自動化合成儀：1980年代，首臺商業(yè)多肽合成儀問世，大幅提升了合成通量和精度。

3、成熟與擴(kuò)展（1990年代至今）---- 樹脂與試劑的優(yōu)化：開發(fā)了高載量、親水性的PEG修飾樹脂（如Tentagel），以及高效偶聯(lián)試劑（如HBTU、HATU）。應(yīng)用拓展：從多肽延伸至寡核苷酸、多糖及小分子化合物合成。技術(shù)融合：微波輔助合成、流動化學(xué)等新方法進(jìn)一步縮短反應(yīng)時(shí)間并提高產(chǎn)率。

三、技術(shù)詳解 1. 基本原理與步驟

固相載體：常用樹脂包括聚苯乙烯（疏水性）和PEG接枝樹脂（親水性），功能基團(tuán)如Wang樹脂（羥基）、Rink酰胺樹脂（氨基）決定產(chǎn)物C端結(jié)構(gòu)。

保護(hù)策略：

Boc法：Boc保護(hù)氨基，需TFA脫保護(hù)；適合短肽，但長鏈易因強(qiáng)酸累積損傷。

Fmoc法：Fmoc保護(hù)氨基，哌啶脫保護(hù)；條件溫和，兼容側(cè)鏈多樣化保護(hù)（如t-Bu、Trt基團(tuán)）。

要成功合成具有特定的氨基酸順序的多肽，需要對暫不參與形成酰胺鍵的氨基和羧基加以保護(hù)，同時(shí)對氨基酸側(cè)鏈上的活性基因也要保護(hù)，反應(yīng)完成后再將保護(hù)基因除去。同液相合成一樣，固相合成中多采用烷氧羰基類型作為α氨基的保護(hù)基，因?yàn)檫@樣不易發(fā)生消旋。最早是用芐氧羰基，由于它需要較強(qiáng)的酸解條件才能脫除，所以后來改為叔丁氧羰基（BOC）保護(hù)，用TFA（三氟乙酸）脫保護(hù)，但不適用含有色氨酸等對酸不穩(wěn)定的肽類的合成。changMeienlofer和Atherton等人采用Carpino報(bào)道的Fmoc(9-芴甲氧羰基)作為α氨基保護(hù)基，F(xiàn)moc基對酸很穩(wěn)定，但能用哌啶-CH2CL2或哌啶-DMF脫去，近年來，F(xiàn)moc合成法得到了廣泛的應(yīng)用。羧基通常用形成酯基的方法進(jìn)行保護(hù)。甲酯和乙酯是逐步合成中保護(hù)羧基的常用方法，可通過皂化除去或轉(zhuǎn)變?yōu)殡乱员阌糜谄瑪嘟M合；叔丁酯在酸性條件下除去；芐酯常用催化氫化除去。對于合成含有半胱氨酸、組氨酸、精氨酸等帶側(cè)鏈功能基的氨基酸的肽來說，為了避免由于側(cè)鏈功能團(tuán)所帶來的副反應(yīng)，一般也需要用適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基將側(cè)鏈基團(tuán)暫時(shí)保護(hù)起來。保護(hù)基的選擇既要保證側(cè)鏈基團(tuán)不參與形成酰胺的反應(yīng)，又要保證在肽合成過程中不受破壞，同時(shí)又要保證在最后肽鏈裂解時(shí)能被除去。如用三苯甲基保護(hù)半胱氨酸的S-，用酸或銀鹽、汞鹽除去；組氨酸的咪唑環(huán)用2,2,2-三氟-1-芐氧羰基和2,2,2-三氟-1-叔丁氧羰基乙基保護(hù)，可通過催化氫化或冷的三氟乙酸脫去。精氨酸用金剛烷氧羰基（Adoc）保護(hù)，用冷的三氟乙酸脫去。

固相中的接肽反應(yīng)原理與液相中的基本一致，將兩個(gè)相應(yīng)的氨基被保護(hù)的及羧基被保護(hù)的氨基酸放在溶液內(nèi)并不形成肽鍵，要形成酰胺鍵，經(jīng)常用的手段是將羧基活化，變成混合酸酐、活潑酯、酰氯或用強(qiáng)的失去劑（如碳二亞氨）形成對稱酸酐等方法來形成酰胺鍵。其中選用DCC、HOBT或HOBT/DCC的對稱酸酐法、活化酯法接肽應(yīng)用最廣。

裂解及合成肽鏈的純化 BOC法用TFA+HF裂解和脫側(cè)鏈保護(hù)基，F(xiàn)MOC法直接用TFA，有時(shí)根據(jù)條件不同，其它堿、光解、氟離子和氫解等脫保護(hù)方法也被采用。合成肽鏈進(jìn)一步的精制、分離與純化通常采用高效液相色譜、親和層析、毛細(xì)管電泳等。

合成循環(huán)：

• 脫保護(hù)：移除氨基保護(hù)基（Fmoc用20%哌啶/DMF）。

• 偶聯(lián)：活化羧酸的氨基酸（如用HBTU/HOBt/DIEA）與樹脂上的游離氨基反應(yīng)。

• 洗滌：DMF、DCM等溶劑去除未反應(yīng)試劑。

切割與純化：合成完成后，用TFA（含清除劑如H?O、TIS）切割樹脂與多肽間的連接鍵，經(jīng)HPLC和質(zhì)譜純化鑒定。

2. 關(guān)鍵試劑與載體

偶聯(lián)試劑：HBTU/HATU（提高偶聯(lián)效率）、DIC/Oxyma（減少消旋化）。

樹脂類型：

Wang樹脂：適用于羧酸終產(chǎn)物（如游離酸或酯）。

Rink酰胺樹脂：生成C端酰胺化多肽（類似天然蛋白結(jié)構(gòu)）。

側(cè)鏈保護(hù)基：如Trityl（Trt）保護(hù)半胱氨酸，Pbf保護(hù)精氨酸，防止副反應(yīng)。

C端羧肽合成可選用Wang樹脂；對于C端酰胺肽的合成，可選擇Rink Amide AM Resin或Rink Amide MBHA Resin；對于全保護(hù)肽的合成，我們可以選擇2-Cl Trt Resin。

樹脂的參數(shù)及其含義：
一般樹脂的參數(shù)包括載量、目數(shù)和規(guī)格，如1% DVB。
載量：單位為mmol/g，即每克樹脂存在多少毫摩爾官能團(tuán)。
目數(shù)：粒度一般為100-200目，數(shù)值越大，顆粒越細(xì)。
1% DVB：交聯(lián)劑二乙烯基苯在苯乙烯和二乙烯基苯共聚物中的比例。

固相多肽合成廣泛應(yīng)用于藥物開發(fā)領(lǐng)域，如合成胰島素類似物、GLP-1受體激動劑（如利拉魯肽），定制表位肽用于抗體生產(chǎn)或蛋白相互作用研究。固相合成技術(shù)正朝著高通量、綠色化學(xué)（減少溶劑浪費(fèi)）和智能化（AI優(yōu)化序列設(shè)計(jì)）方向發(fā)展。新型載體（如可降解樹脂）和連續(xù)流反應(yīng)器有望進(jìn)一步突破合成極限，推動合成生物學(xué)與精準(zhǔn)醫(yī)療的進(jìn)步。

參考文獻(xiàn)：

1. Merrifield, R.B. (1963). J. Am. Chem. Soc., 85(14), 2149–2154.

2. Chan, W.C., & White, P.D. (2000). Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. Oxford University Press.

3. Henninot, A., et al. (2018). J. Med. Chem., 61(4), 1382–1414.

固相多肽合成中可能出現(xiàn)的問題：

1. 什么是凈肽含量（肽含量），其意義是什么？
多肽的干重不僅包含肽本身，還包括水分、吸附溶劑、配位離子及鹽類等非肽成分。凈肽含量指肽在該混合物中的重量百分比，范圍通常在50%-90%之間，具體取決于純度、序列及合成/純化方法。凈肽含量不可與肽純度混淆——二者概念不同：純度通過高效液相色譜（HPLC）測定，表示正確序列組分的百分比；而凈肽含量量化的是肽材料相對于非肽物質(zhì)的比例。凈肽含量通常通過氨基酸組成分析或紫外分光光度法測定，這對肽濃度敏感的實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要。

2. 多肽生產(chǎn)的常用方法有哪些？
線性肽采用Fmoc固相法從C端向N端延伸合成。首個(gè)氨基酸通過酸敏連接劑固定于不溶性樹脂上，經(jīng)哌啶去除Fmoc保護(hù)基后，耦聯(lián)第二個(gè)Fmoc保護(hù)氨基酸。活化方式包括預(yù)活化或“一鍋法”。完成目標(biāo)序列后，用三氟乙酸（TFA）將肽從樹脂上切下，獲得粗產(chǎn)物。

3. 如何根據(jù)實(shí)驗(yàn)選擇肽純度？

純度需求依實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩ǎ?/p>

• 篩選實(shí)驗(yàn)（低靈敏度）：粗品＞75%

• 免疫實(shí)驗(yàn)：＞85%

• 受體-配體研究、生物測定或細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：＞95%

• 結(jié)構(gòu)研究：＞98%

4. 為何合成含Cys、Met或Trp的肽較困難？
這些殘基易氧化，合成高純度含此類殘基的肽需特殊工藝，儲存時(shí)需避免反復(fù)接觸空氣。

5. 若肽純度為95%，剩余5%是什么？
主要為耦聯(lián)步驟不完善產(chǎn)生的氨基酸缺失副產(chǎn)物，因其色譜性質(zhì)相似，常與目標(biāo)肽共同洗脫。

6. 未HPLC純化的肽含哪些雜質(zhì)？
粗品或脫鹽肽可能含截短肽、殘留溶劑（如DTT、TFA）及合成試劑。

7. 最佳肽長度是多少？
合成效率隨長度增加（＞20殘基）下降。短肽（5殘基）建議使用疏水性氨基酸以簡化純化；功能域兩側(cè)建議添加親水/帶電殘基提升溶解性。

8. 如何從序列預(yù)測肽溶解性？

• 疏水殘基（Leu、Val、Ile、Met、Phe、Trp）＞50%：可能難溶于水

• 帶電殘基（Lys、Arg、His、Asp、Glu）≥20%：溶解性佳

• 中性肽：需有機(jī)溶劑（如DMSO、乙腈）

9. 如何純化多肽？采用反相HPLC（C8/C18柱），以TFA/乙腈梯度洗脫。疏水肽可能需甲酸或乙酸。長肽（＞20aa）需質(zhì)譜鑒定目標(biāo)峰。

10. 如何計(jì)算Fmoc-氨基酸樹脂載量？
兩種方法：
(1) 耦聯(lián)后增重除以分子量與樹脂質(zhì)量
(2) 紫外吸光度分析：如果肽段序列中含有Trp或Tyr，可用紫外法分析肽段的含量，根據(jù)摩爾消光系數(shù)：
色氨酸 5,560 AU/mmole/ml
酪氨酸 1,200 AU/mmole/ml
（280 nm at 中性pH使用 1 cm 比色皿）
肽的摩爾消光系數(shù)可以根據(jù)每個(gè)色氨酸或酪氨酸的系數(shù)相加，然后根據(jù)在 280 nm 處測得的吸光值按公式計(jì)算。
mg 肽/ml = (A280 x DF x MW) / e
A280，280 nm 處的實(shí)際吸收值（1 cm 池），
DF，稀釋因子，
MW，肽的分子量
e，肽的摩爾消光系數(shù)

11. 如何溶解多肽？

• 凈電荷＞0（堿性）：溶于水；可加乙酸（≥10%）或TFA

• 凈電荷=0（酸性）：溶于水；可加氨水

• 中性電荷：用有機(jī)溶劑（如DMSO、乙腈）或尿素

12. 如何儲存合成肽？

• 長期：凍干、干燥后-20°C保存

• 含Cys/Met/Trp的肽：用脫氧緩沖液；避免反復(fù)凍融

• 含Gln/Asn的肽：因易降解，保質(zhì)期有限

13. 如何處理肽末端？

肽用于模擬蛋白質(zhì)。為了模擬蛋白質(zhì)的表達(dá)，我們需要合成與蛋白質(zhì)具有相似結(jié)構(gòu)和電荷的肽。當(dāng)一個(gè)肽從蛋白質(zhì)中“切出”時(shí)，兩端的電荷數(shù)將與基因體蛋白的電荷數(shù)不同。我們需要改變合成策略以使它們保持一致。一般來說，如果來自蛋白質(zhì)的C端，N端被乙酰化屏蔽；如果它來自蛋白質(zhì)的N端，則C端被酰胺化屏蔽；如果它來自蛋白質(zhì)的中間部分，則兩端被乙?；王０坊帘?。

編輯自：

1、

2、百度百科：https://baike.baidu.com/item/%E5%A4%9A%E8%82%BD%E5%9B%BA%E7%9B%B8%E5%90%88%E6%88%90%E6%B3%95/7327635