新型生物混合手性水凝膠為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤術(shù)后治療帶來新突破

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）是最常見且難以治愈的腦腫瘤，由于其對手術(shù)、放療、化療和免疫治療等多種治療手段的內(nèi)在和適應(yīng)性抵抗，患者中位生存期僅12-15個(gè)月。越來越多的證據(jù)表明，具有自我更新、分化、致瘤性、侵襲和代謝適應(yīng)能力的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞（GSC）群體是腫瘤切除不全、放療抵抗、化療抵抗、免疫逃逸以及最終GBM復(fù)發(fā)的根本原因。盡管徹底清除手術(shù)后的殘留GSC被認(rèn)為是治療GBM患者的必然目標(biāo)，但目前尚無臨床批準(zhǔn)的GSC特異性療法。臨床前和臨床研究主要集中于通過靶向和抑制干性相關(guān)的核心信號因子來提高GSC的術(shù)后敏感性，然而，由于腫瘤間異質(zhì)性以及GSC信號系統(tǒng)內(nèi)部的補(bǔ)償和冗余機(jī)制，將現(xiàn)有療法的成功擴(kuò)展到更廣泛的GBM患者群體仍然面臨巨大挑戰(zhàn)。

近日，福州大學(xué)林立森教授、新加坡國立大學(xué)陳小元教授合作報(bào)道了一種生物混合納米顆粒（NP）嵌入的手性水凝膠，旨在全面調(diào)控GSC干性，以增強(qiáng)術(shù)后治療并抑制GBM復(fù)發(fā)。這種水凝膠封裝了由GSC膜包裹的納米顆粒（GSNP），可作為廣譜細(xì)胞因子誘餌，中和多種促干性和趨化細(xì)胞因子。此外，研究發(fā)現(xiàn)D-手性生物混合水凝膠（D-gel@GSNP）相較于其L-和DL-手性對應(yīng)物，能通過D-手性幾何結(jié)構(gòu)調(diào)控的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)一步削弱GSC的干性表型。在三種原位顱內(nèi)GBM模型中，這種對GSC干性的多角度抑制增強(qiáng)了基于金納米簇的水凝膠支架增敏的放射免疫治療，有效抑制了切除后的GBM復(fù)發(fā)。相關(guān)論文以“A biohybrid chiral hydrogel enhances preclinical postoperative glioblastoma therapy by multi-pronged inhibition of tumour stemness”為題，發(fā)表在

Nature Nanotechnology

研究人員首先制備并表征了GSNP封裝的手性水凝膠。透射電子顯微鏡圖像顯示GSNP具有典型的核殼結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)印跡分析證實(shí)了關(guān)鍵的促干性因子受體成功從GSC膜轉(zhuǎn)移至納米顆粒表面。通過將手性組氨酸與手性硫代巴比妥酸修飾的金納米簇共組裝，構(gòu)建了封裝GSNP的D-、L-或DL-手性水凝膠。圓二色光譜和掃描電子顯微鏡分析證實(shí)了水凝膠的手性特征，并且D-和L-手性水凝膠呈現(xiàn)出相反的扭曲分層蝴蝶結(jié)狀聚集體結(jié)構(gòu)。體外降解和釋放曲線表明水凝膠在腦脊液環(huán)境中可緩慢降解，GSNP的釋放與凝膠降解同步。

圖1 | GSNP封裝的手性水凝膠表征。 a, b, GSNP的透射電子顯微鏡圖像（a）和尺寸分布（b）。c, 關(guān)鍵促干性因子受體的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果。數(shù)據(jù)代表兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，結(jié)果相似。d, 通過量化熒光強(qiáng)度比較GSNP和GSC上的CXCR4水平。e, 水凝膠的冷凍掃描電子顯微鏡圖像。f, 注射后具有不同幾何形狀的酚紅染色水凝膠的代表性照片。g, TBA-AuNC和水凝膠的O1s峰的高分辨率X射線光電子能譜。h, 不同樣品的相應(yīng)圓二色譜。i, D-手性、L-手性和外消旋水凝膠的掃描電子顯微鏡圖像。插圖：具有不同手性的分層蝴蝶結(jié)狀聚集體的示意圖。j, 水凝膠的高角度環(huán)形暗場掃描透射電子顯微鏡圖像及相應(yīng)的元素分布圖。圖像經(jīng)偽彩色處理以指示元素組成。k, 水凝膠在不同介質(zhì)中的剩余質(zhì)量。l, 水凝膠在腫瘤切除腔內(nèi)的體內(nèi)剩余質(zhì)量。k和l中的百分比相對于水凝膠初始質(zhì)量計(jì)算。m, 隨著水凝膠降解，GSNP從水凝膠中的釋放曲線。插圖顯示了短期（0-7天）內(nèi)的GSNP釋放曲線。a, b, e–j中的數(shù)據(jù)代表三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，結(jié)果相似。d, k–m中的數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n = 3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)）。

體外實(shí)驗(yàn)評估了該平臺減少GSC干性的效果。含有GSNP的水凝膠能有效結(jié)合IL-6、PTN、CXCL12、TGF-β和WNT等促干性細(xì)胞因子。在細(xì)胞因子混合物存在下，D-gel@GSNP能顯著減少非干細(xì)胞向GSC的轉(zhuǎn)化，并降低已分選GSC群體的干性標(biāo)志物表達(dá)、腫瘤球形成能力和體內(nèi)致瘤性。轉(zhuǎn)錄組分析顯示，經(jīng)D-gel@GSNP處理的GSC中干性相關(guān)基因表達(dá)顯著下調(diào)，與未處理的非干細(xì)胞群體水平相當(dāng)。機(jī)制研究表明，D-手性基質(zhì)對纖維連接蛋白的親和力較低，導(dǎo)致整合素信號下調(diào)，進(jìn)而抑制了FAK/PI3K/AKT和YAP/TAZ等關(guān)鍵干性維持通路的激活。同時(shí)，GSNP對細(xì)胞因子的中和也協(xié)同抑制了STAT3和NF-κB信號。

圖2 | D-gel@GSNP在體外減少干性。 a, 封裝不同濃度GSNP或裸PLGA核的手性水凝膠對IL-6、PTN、CXCL12、TGF-β和WNT的結(jié)合能力。插圖展示了從結(jié)合曲線得出的IC50值，定義為對應(yīng)于50%細(xì)胞因子結(jié)合的水凝膠中GSNP濃度。b, 在細(xì)胞因子混合物存在下，GL261細(xì)胞朝向不同水凝膠配方的趨化指數(shù)。c, 不同處理后SP細(xì)胞的CD133和SOX2免疫熒光染色。d, 根據(jù)c圖對CD133+SOX2+細(xì)胞的定量。e, 經(jīng)不同處理的Hoechst+ CD133+細(xì)胞的CD133和SOX2免疫熒光圖像。f, 不同組中CD133+SOX2+細(xì)胞的百分比。g, 處理后細(xì)胞形成的腫瘤球的代表性圖像。h, 腫瘤球形成效率，表示為每組腫瘤球數(shù)量相對于PBS組的百分比。i, 每個(gè)視野平均腫瘤球直徑相對于PBS組的百分比。j, 顯示顱內(nèi)腫瘤的全腦切片H&E染色代表性圖像，以及在第18天接種腫瘤后植入各組細(xì)胞的小鼠的體內(nèi)生物發(fā)光圖像，指示腫瘤負(fù)荷。k, 腦切片中腫瘤大小與大腦大小的比率。l, 第18天接種腫瘤后荷瘤小鼠的生物發(fā)光信號強(qiáng)度。c和e中顯示了Cy3標(biāo)記的CD133（干細(xì)胞表面標(biāo)志物，紅色）、FITC標(biāo)記的SOX2（干性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，綠色）和DAPI染色的細(xì)胞核（藍(lán)色）。c, e, g, j中的數(shù)據(jù)代表三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，結(jié)果相似。a, d, f, h, i, k, l中的數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n = 3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)）。b中的數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n = 5次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)）。通過單因素方差分析和Tukey多重比較檢驗(yàn)評估統(tǒng)計(jì)顯著性。

研究進(jìn)一步探討了該平臺在恢復(fù)GSC治療敏感性方面的作用。水凝膠中釋放的金納米簇被招募至凝膠內(nèi)的GSC攝取。在X射線照射下，D-gel@GSNP處理組表現(xiàn)出最高的細(xì)胞死亡率和DNA損傷標(biāo)志物γH2AX水平。此外，D-gel@GSNP聯(lián)合放療能有效誘導(dǎo)GSC發(fā)生免疫原性細(xì)胞死亡，表現(xiàn)為鈣網(wǎng)蛋白暴露、HMGB1和ATP釋放增加，并促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的成熟。

圖3 | D-gel@GSNP介導(dǎo)的體外干性減少機(jī)制、放射增敏和免疫刺激。 a, 熱圖顯示處理后GL261細(xì)胞中的差異表達(dá)基因（左）和干性相關(guān)基因（右）。b, 差異表達(dá)基因和干性相關(guān)基因簇的火山圖。c, 桑基圖加點(diǎn)圖顯示下調(diào)差異表達(dá)基因的通路富集分析。d, 通過免疫熒光染色分析確定的纖維連接蛋白與各種凝膠之間的結(jié)合親和力。熒光值歸一化至每組的最大強(qiáng)度。下圖：纖維連接蛋白吸附的代表性免疫熒光圖像和相應(yīng)的三維表面圖圖像。e, 與FAK/PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白的蛋白質(zhì)印跡分析。數(shù)據(jù)代表兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，結(jié)果相似。f, vinculin和YAP表達(dá)的免疫熒光分析及核轉(zhuǎn)位。g, D-gel@GSNP介導(dǎo)GSC通路阻斷的分子機(jī)制示意圖。h, transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)示意圖。i, 顯示細(xì)胞在各種水凝膠中浸潤的三維共聚焦圖像。j, 與水凝膠共孵育的收集細(xì)胞的共聚焦圖像。k, 經(jīng)各種水凝膠和不同劑量X射線處理的Hoechst+ CD133+細(xì)胞的活力。l, 通過彗星實(shí)驗(yàn)檢測處理后細(xì)胞的DNA損傷。m, 處理后細(xì)胞中γH2AX和H2AX蛋白的蛋白質(zhì)印跡分析。數(shù)據(jù)代表兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，結(jié)果相似。n, CRT暴露的熒光圖像。o, CRT+細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)定量。p, 用于評估DC成熟的transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)示意圖。q, 與處理的GSC共培養(yǎng)后成熟DC的流式細(xì)胞術(shù)圖。

在GL261-GBM原位小鼠模型中，術(shù)后在切除腔注射D-gel@GSNP證實(shí)了其招募CXCR4+ CD133+ GSC的能力，并能有效降低局部促干性細(xì)胞因子水平。聯(lián)合分次放療后，D-gel@GSNP展現(xiàn)出最強(qiáng)的抑制腫瘤復(fù)發(fā)和延長生存期的效果，且未觀察到明顯毒性。該治療還激發(fā)了抗腫瘤免疫反應(yīng)，包括增加腫瘤內(nèi)CD8+和CD4+ T細(xì)胞浸潤、減少免疫抑制性M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞和髓源性抑制細(xì)胞，并誘導(dǎo)效應(yīng)記憶T細(xì)胞的生成。聯(lián)合抗PD1抗體可進(jìn)一步改善治療效果。

圖4 | D-gel@GSNP與放療聯(lián)合在GL261-GBM小鼠模型中抑制復(fù)發(fā)。 a, GL261-GBM切除小鼠模型的治療時(shí)間表示意圖。b, 第12天接種腫瘤后對荷GL261-GBM小鼠進(jìn)行手術(shù)腫瘤切除。c, 接受手術(shù)減瘤的荷GL261-GBM小鼠腦組織的H&E染色顯微圖像，顯示皮層腫瘤區(qū)域內(nèi)的切除腔。數(shù)據(jù)代表三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，結(jié)果相似。d, 通過生物發(fā)光信號檢測到的Luc+ GL261細(xì)胞向水凝膠的體內(nèi)浸潤。e, f, 含有GSNP或NP的水凝膠中DCs、巨噬細(xì)胞和GSCs的百分比（e）和數(shù)量（f）。g, 封裝GSNP或PLGA核的手性水凝膠對IL-6、PTN、CXCL12、TGF-β和WNT的體內(nèi)結(jié)合能力。h, i, 接受不同治療的術(shù)后荷GL261-GBM小鼠的體內(nèi)生物發(fā)光圖像（h）和信號強(qiáng)度定量（i）。j, 所有組治療小鼠的生存曲線。k, 治療期間體重變化曲線。

為評估臨床潛力，研究在患者來源異種移植（PDX）GBM模型中進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果顯示，D-gel@GSNP-aPD1聯(lián)合放療能下調(diào)腫瘤干性基因表達(dá)，顯著抑制腫瘤復(fù)發(fā)，延長小鼠生存期，且安全性良好。在更具侵襲性和免疫抑制性的CT2A-GBM模型中，D-gel@GSNP-aPD1與標(biāo)準(zhǔn)療法（手術(shù)切除后聯(lián)合同步放化療）聯(lián)合，相比單純標(biāo)準(zhǔn)療法，能更有效地抑制術(shù)后復(fù)發(fā)并調(diào)節(jié)免疫抑制性腫瘤微環(huán)境。

圖5 | D-gel@GSNP與放療聯(lián)合在GL261-GBM模型中的免疫刺激作用及在PDX-GBM模型中的復(fù)發(fā)抑制。 a, D-gel@GSNP + RT治療后TUNEL染色腦切片的熒光圖像。b, CRT暴露和HMGB1釋放的流式細(xì)胞術(shù)分析。c, 淋巴結(jié)中成熟DCs的百分比。d, e, 腫瘤浸潤C(jī)D8+ T細(xì)胞和CD4+ T細(xì)胞的百分比。f, g, GL261-GBM腫瘤中CD8+效應(yīng)記憶T細(xì)胞和CD4+效應(yīng)記憶T細(xì)胞的比例。h, 含有GL261 GSCM的GSNP-aPDI的SDS-PAGE分析。數(shù)據(jù)代表兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，結(jié)果相似。i, 在有或無X射線照射處理下從凝膠中釋放的aPDI百分比。j, 接受不同治療的術(shù)后荷GL261-GBM小鼠的體內(nèi)生物發(fā)光圖像和定量。l, m, GL261-GBM腫瘤中CD4+ CD44+ CD62L- T細(xì)胞和CD8+ CD44+ CD62L- T細(xì)胞的比例。n, GL261-GBM腫瘤中活化T細(xì)胞的百分比。o, 治療小鼠的生存曲線。p, 治療期間治療小鼠的體重變化曲線。q, PDX-GBM模型治療時(shí)間表示意圖。r, 通過qRT-PCR分析檢測的腦腫瘤組織中GSC干性相關(guān)基因的相對mRNA表達(dá)。

圖6 | D-gel@GSNP-aPDI與標(biāo)準(zhǔn)GBM療法聯(lián)合在CT2A-GBM小鼠模型中抑制復(fù)發(fā)和免疫刺激。 a, 通過生物發(fā)光信號檢測到的體內(nèi)Luc+ CT2A細(xì)胞向水凝膠的浸潤。b, 含有GSNP或NP的水凝膠中DCs、巨噬細(xì)胞和GSCs的百分比和數(shù)量。c, 通過RT-PCR分析檢測的腦腫瘤組織中GSC干性相關(guān)基因的相對mRNA表達(dá)。d, e, 接受不同治療的術(shù)后荷CT2A-GBM小鼠的體內(nèi)生物發(fā)光圖像和信號強(qiáng)度定量。f, 治療小鼠的生存曲線。g, 治療期間體重變化曲線。h-k, CT2A-GBM或GL261-GBM腫瘤中不同T細(xì)胞亞群的百分比。l, CT2A-GBM中CD3+ CD8+ Ki67+ T細(xì)胞的百分比。m, n, CT2A-GBM腫瘤中CD3+ CD8+ GZMB+和CD3+ CD8+ IFNγ+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的百分比。o, CT2A-GBM腫瘤中CD3+ CD4+ FoxP3+ Treg細(xì)胞的百分比。p, CT2A-GBM腫瘤中CD45+ CD3- NK1.1+ NK細(xì)胞的百分比。q, r, CT2A-GBM腫瘤中CD45+ NK1.1+ GZMB+和CD45+ NK1.1+ IFNγ+細(xì)胞毒性NK細(xì)胞的百分比。

綜上所述，該研究開發(fā)的生物混合手性水凝膠平臺，通過整合GSC膜納米誘餌的細(xì)胞因子中和能力與D-手性基質(zhì)的物理調(diào)控作用，實(shí)現(xiàn)了對GSC干性的多維度抑制。結(jié)合局部放射增敏和免疫調(diào)節(jié)，該策略在多種臨床前GBM模型中均展現(xiàn)出強(qiáng)大的抑制術(shù)后復(fù)發(fā)和延長生存的潛力。這項(xiàng)工作不僅為GBM術(shù)后治療提供了一種有前景的新策略，其基于膜涂層技術(shù)和手性工程材料的生物混合平臺思路，也有望擴(kuò)展到其他富含癌癥干細(xì)胞的惡性腫瘤治療中。未來的臨床轉(zhuǎn)化需關(guān)注倫理合規(guī)的細(xì)胞膜來源以及更貼近人體疾病特征的動物模型驗(yàn)證。