PROTAC（Proteolysis Targeting Chimera）技術(shù)作為近年來生物醫(yī)藥領(lǐng)域的革命性突破，憑借 “靶向蛋白降解” 的獨特機制，為傳統(tǒng)“不可成藥”靶點的藥物研發(fā)提供了全新路徑。長期以來，配體-靶蛋白親和力被默認為 PROTAC 降解效率的核心決定因素，業(yè)內(nèi)普遍存在 “配體親和度越高，PROTAC 降解活性越強” 的認知慣性，高親和配體成為研發(fā)首選。

然而，近期發(fā)表于Angewandte的重磅研究，通過系統(tǒng)性實驗驗證，揭示了中等親和配體（Kd 處于納摩爾至微摩爾級別），在 PROTAC 介導的靶向蛋白降解中，展現(xiàn)出更均衡的高效性、選擇性與成藥潛力，為 PROTAC 的理性設(shè)計提供了新的科學范式。

“不可成藥” 剪接體蛋白的靶向突破

1. USP39 的生物學功能與成藥挑戰(zhàn)

USP39（泛素特異性蛋白酶 39）作為剪接體核心組件，參與 U4/U6.U5 三小核核糖核蛋白復(fù)合物組裝，對 RNA 剪接保真度至關(guān)重要，其功能異常與腫瘤發(fā)生、神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)。然而，USP39 缺乏經(jīng)典蛋白酶的催化活性口袋（關(guān)鍵催化殘基組氨酸和半胱氨酸缺失），且主要通過表面構(gòu)象與其他剪接因子相互作用，傳統(tǒng)小分子抑制劑難以靶向結(jié)合，長期被歸為 “不可成藥” 靶點。

圖1：USP39 表達構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)域架構(gòu)及篩選出的配體

2. 中等親和配體的發(fā)現(xiàn)與優(yōu)化

研究團隊通過 DNA 編碼庫篩選（約 6 億個化合物）與靶向生物活性庫篩選（200 個化合物），雙重平臺共同識別出含噻唑骨架的中等親和配體（USP39_B1、USP39_B2）。AlphaFold3 結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，USP39 包含無折疊的 RS 樣結(jié)構(gòu)域、核心鋅指（ZNF）結(jié)構(gòu)域和 USP 結(jié)構(gòu)域，配體主要通過氫鍵與 π-π 堆積作用結(jié)合 ZNF 結(jié)構(gòu)域的 Tyr142、Gly140 等殘基，形成特異性相互作用（Kd=3 μM）。通過定點突變驗證（Phe120、Leu123、Tyr142 三重突變后結(jié)合活性完全喪失），明確了配體與 ZNF 結(jié)構(gòu)域的結(jié)合特異性。

進一步通過結(jié)構(gòu) - 活性關(guān)系（SAR）優(yōu)化，將配體苯環(huán)氯取代基替換為間位氟原子（USP39_B3），結(jié)合親和力提升至IC50=1.18 μM，同時保留了溶劑暴露的修飾位點，為 PROTAC 設(shè)計預(yù)留了 linker 連接空間。

圖2：蛋白與分子互作

3. PROTAC 設(shè)計與性能驗證

基于優(yōu)化后的中等親和配體，研究團隊設(shè)計合成了 60 個 PROTAC 分子（20 個 VHL 介導型、40 個 CRBN 介導型），重點優(yōu)化 linker 長度與化學組成：最終篩選出的 USP39_PROTAC_V1 采用 PEG3 linker 增強水溶性，通過 VHL E3 連接酶介導降解，其與 USP39 的結(jié)合親和力達 Kd=136 nM（ITC 驗證），三元復(fù)合物形成常數(shù) Kd=232 nM（Alpha assay 驗證），顯著優(yōu)于親本配體。

細胞層面，USP39_PROTAC_V1 展現(xiàn)出強效降解活性：1 nM濃度處理 24 小時即可實現(xiàn) HeLa、HEK293T、LNCaP 等多種細胞系中 USP39 的高效降解，6 小時處理的 DC50 為 5 nM，24 小時 DC50 降至 1.06 nM；濃度高于 500 nM 時觀察到明顯hook effect。蛋白質(zhì)組學分析（覆蓋 6000 余種蛋白）顯示，除 USP39 外，僅 應(yīng)激相關(guān)蛋白 NDRG1 和 ISG15 出現(xiàn)輕微下調(diào)，同源蛋白 USP5、USP10 無明顯變化，證實其高靶向選擇性。

研究發(fā)現(xiàn)噻唑類配體，分子與 USP39 的結(jié)合主要依賴特異性氫鍵和芳香堆積作用，而非與蛋白深部疏水口袋的相互作用，且顯著誘導了 USP39 的熱穩(wěn)定性下降。配體結(jié)合通常會提高激酶這類具有明確疏水空腔蛋白的熱穩(wěn)定性，因此配體誘導的蛋白穩(wěn)定性降低并不常見。但對于缺乏結(jié)構(gòu)化結(jié)合口袋的蛋白（如多結(jié)構(gòu)域支架蛋白或 RNA 結(jié)合蛋白），則可能出現(xiàn)這種相反的效應(yīng)。對于缺乏經(jīng)典催化口袋的 USP39 而言，小分子化合物的結(jié)合很可能擾亂了其表面維持穩(wěn)定性的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，或改變了鋅指結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象，進而降低了蛋白的整體穩(wěn)定性。因此，研究證實，化學誘導的鄰近效應(yīng)能夠有效靶向剪接體組分 USP39 這類傳統(tǒng)意義上的不可成藥蛋白。研究結(jié)果強調(diào)，中等親和力配體可通過 PROTAC 技術(shù)驅(qū)動高效且特異的蛋白降解，這也凸顯了在促進三元復(fù)合物高效形成的過程中，結(jié)合動力學特性比絕對親和力更為關(guān)鍵。

圖3：PROTACs可實現(xiàn)細胞內(nèi) USP39 的高效、特異性降解

無獨有偶，Chessum等人成功開發(fā)了針對非催化蛋白Pirin的PROTAC——CCT251236，雖然它只是中等親和配體，但其具有良好的口服生物利用度、半衰期以及極佳的體外細胞活性，成藥特性尤為突出。同樣，Han等人開發(fā)針對雄激素受體（AR）的PROTAC——ARD-69，其雖然與目標蛋白或E3連接酶之間只有適度親和力，卻仍可實現(xiàn)顯著降解，在細胞與動物實驗中展現(xiàn)出卓越性能：在 LNCaP、VCaP 和 22Rv1 三種 AR 陽性前列腺癌細胞中，DC50 分別低至 0.86 nM、0.76 nM 和 10.4 nM，最大降解率（Dmax）均超過 95%。

圖4：A. CCT251236；B. ARD-69

中等親和配體的核心優(yōu)勢與機制解析

1.規(guī)避hook effect，穩(wěn)定三元復(fù)合物的形成

PROTAC 的降解效率依賴“靶蛋白 - PROTAC-E3 酶” 三元復(fù)合物的動態(tài)平衡。中等親和配體的結(jié)合強度適中，既能保證與靶蛋白的特異性相互作用，又能為 E3 酶的招募預(yù)留足夠空間構(gòu)象，使三元復(fù)合物在較寬濃度范圍內(nèi)保持穩(wěn)定，避免高親和配體因過度結(jié)合導致的橋梁斷裂。

2. 提升靶向選擇性，降低脫靶風險

高親和配體多通過強疏水相互作用結(jié)合靶蛋白，易與結(jié)構(gòu)同源蛋白交叉反應(yīng)；而中等親和配體的結(jié)合更依賴靶蛋白特有的構(gòu)象特征，（如 USP39 的鋅指結(jié)構(gòu)域、Pirin 的特定表面環(huán)），這種 “構(gòu)象依賴性結(jié)合” 顯著提升了配體的靶向特異性。此外，蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)顯示，基于中等親和配體的 PROTAC 脫靶降解事件極少，安全性優(yōu)勢顯著。

3. 優(yōu)化理化性質(zhì)，改善成藥潛力

中等親和配體無需過度依賴疏水相互作用增強結(jié)合，結(jié)構(gòu)設(shè)計更靈活，易實現(xiàn)水溶性、脂溶性及代謝穩(wěn)定性的平衡，如 CCT251236 在小鼠體內(nèi)雖然未結(jié)合清除率高，但其成藥性良好， 降低了 PROTAC 從實驗室走向臨床的轉(zhuǎn)化難度。

參考文獻：

• Han, X., et al. Discovery of ARD-69 as a Highly Potent PROTAC Degrader of Androgen Receptor for the Treatment of Prostate Cancer. J. Med. Chem. 2019, 62, 941?964.

• Sch?fer, D., et al. Targeting the Spliceosomal Protein USP39 Through Allosteric Ligands and PROTAC-Induced Degradation. Angew. Chem. Int. Ed. 2025, e16809.

• Cheeseman, M. D., et al. Discovery of a Chemical Probe Bisamide (CCT251236): An Orally Bioavailable Efficacious Pirin Ligand from a Heat Shock Transcription Factor 1 Phenotypic Screen. J. Med. Chem. 2017, 60, 180?201.

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