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Introduction

紫陀螺菌（Gomphus purpuraceus（Iwade）Yokoyama）是一種食用歷史悠久的區(qū)域性珍稀野生菌，因肉質(zhì)脆嫩、滋味鮮美、不易腐爛等特點(diǎn)而備受消費(fèi)者喜愛。但由于生態(tài)位的不確定，紫陀螺菌仍未實(shí)現(xiàn)人工馴化栽培。

根據(jù)紫陀螺菌的野外生長環(huán)境調(diào)查和菌根檢查結(jié)果，紫陀螺菌被認(rèn)為是一種外生菌根性真菌。進(jìn)一步通過對紫陀螺菌進(jìn)行全基因組注釋和比較基因組分析發(fā)現(xiàn)，紫陀螺菌與外生菌根性真菌顯示出類似的CAZymes數(shù)量和分布。通過CAZymes的進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，紫陀螺菌基因組中有許多編碼木質(zhì)纖維素降解酶和淀粉酶的基因，這說明紫陀螺菌也有潛在利用木質(zhì)纖維素和淀粉的能力。因此，解析紫陀螺菌的碳源代謝特征對其菌種繁育和資源開發(fā)利用具有重要意義。

貴州省林業(yè)科學(xué)研究院耿陽陽副研究員、貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院秦禮康教授等以貴州特色野生紫陀螺菌為研究對象，利用轉(zhuǎn)錄組結(jié)合蛋白組技術(shù)對4種培養(yǎng)基中的紫陀螺菌進(jìn)行研究，并進(jìn)一步通過培養(yǎng)基形態(tài)和相關(guān)酶活特性來探究紫陀螺菌的最佳碳源。

Results and Discussion

不同培養(yǎng)基中碳水化合物酶的DEGs和DEPs

碳水化合物活性酶家族（CAZymes）參與碳水化合物的合成、代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)，包括糖苷水解酶（GHs）、糖基轉(zhuǎn)移酶（GTs）、多糖裂解酶（PLs）、碳水化合物酯酶（CEs）、輔助活性（AAs）和碳水化合物結(jié)合模塊（CBMs）。紫陀螺菌在四個培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)錄本和蛋白質(zhì)被注釋在CAZy數(shù)據(jù)庫中。所有樣本共有402個轉(zhuǎn)錄本和168個蛋白質(zhì)注釋到CAZy數(shù)據(jù)庫。

在A vs B比較組中，總共有100個DEGs和19個DEPs，其中42個DEGs上調(diào)和6個DEPs上調(diào)。在補(bǔ)充葡萄糖后（B vs D組），發(fā)現(xiàn)有124個DEGs（53個上調(diào)，71個下調(diào)）和23個DEPs（15個上調(diào)，8個下調(diào)）。盡管在培養(yǎng)基C中含有新鮮馬鈴薯，但蛋白胨的缺乏導(dǎo)致了DEGs和DEPs的下調(diào)數(shù)量大于DEGs和DEPs的上調(diào)數(shù)量，特別是GHs和CBMs（A vs C比較組）。這個結(jié)果表明蛋白胨中的某些氨基酸是合成碳水化合物酶所必需的。在C vs D組中，補(bǔ)充蛋白胨后，與CAZymes相關(guān)的上調(diào)DEGs和DEPs數(shù)量略有增加。在富含葡萄糖和蛋白胨的培養(yǎng)基中加入新鮮馬鈴薯汁（A vs D組），能夠促進(jìn)GH5、GH28、GH31、GH92、GH92、AA2、AA3、AA5、AA6、CE8、CE10和CBM13相關(guān)基因的表達(dá)。然而蛋白組數(shù)據(jù)顯示僅有AA2、GH55和GT90中的家族蛋白被上調(diào)。

圖1 不同培養(yǎng)基中碳水化合物酶的DEGs和DEPs

紫陀螺菌中木質(zhì)纖維素降解相關(guān)基因分布

纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶和木質(zhì)素氧化酶家族與木質(zhì)纖維素的降解密切相關(guān)。為進(jìn)一步了解紫陀螺菌的木質(zhì)纖維素降解能力，本研究特別注釋了紫陀螺菌中涉及木質(zhì)纖維素降解的有關(guān)基因。在12個樣本中，紫陀螺菌中共注釋了61個參與木質(zhì)纖維素分解的表達(dá)基因。涉及纖維素酶的表達(dá)基因有19個，主要包括內(nèi)切葡聚糖酶、1,4-β-纖維素生物糖苷酶和β-葡萄糖苷酶。然而，在蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)中僅注釋到5種與纖維素酶相關(guān)的蛋白質(zhì)。對于半纖維素的降解，紫陀螺菌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中尋找出了8個表達(dá)基因，而在蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)中僅鑒定出2個阿魏酸酯酶。對于果膠的降解，紫陀螺菌中的果膠酶有果膠裂解酶（2個轉(zhuǎn)錄本）和聚半乳糖醛酸酶（3個轉(zhuǎn)錄本）。從表達(dá)水平角度分析，在培養(yǎng)基中加入馬鈴薯可顯著促進(jìn)編碼果膠裂解酶基因（EVM0006180）的表達(dá)。木質(zhì)素是植物生物量的主要成分之一。木質(zhì)素的降解主要依賴于含漆酶的多銅氧化酶、錳過氧化物酶（MnP）、木質(zhì)素過氧化物酶（LiPs）和其他過氧化物酶等氧化酶。在12份樣品中共鑒定出22個表達(dá)基因，編碼13種多銅氧化酶（10種漆酶）和9種錳過氧化物酶。然而未發(fā)現(xiàn)編碼木質(zhì)素過氧化物酶（lignin peroxidase）的基因。在這些木質(zhì)素氧化酶基因中，包括多銅氧化酶和錳過氧化物酶在內(nèi)的所有樣品中表達(dá)量最高的基因是EVM0008356（FPKM A-D: 578.59、100.68、50.34、77.12）。然而，在蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)中只檢測到一種與鐵多銅氧化酶相關(guān)的蛋白質(zhì)。EVM0004142編碼的多銅氧化酶是木質(zhì)素氧化酶家族中唯一檢測到的蛋白。最后，在木質(zhì)素降解輔助酶家族（葡萄糖氧化酶、酒精氧化酶、吡喃糖氧化酶、香草醇氧化酶、乙二醛氧化酶、半乳糖氧化酶、苯醌還原酶）中，僅檢測到1個與酒精氧化酶相關(guān)的編碼基因和6個與半乳糖氧化酶相關(guān)的編碼基因。

考慮到蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)中注釋為木質(zhì)纖維素酶的蛋白質(zhì)很少，典型的木質(zhì)纖維素降解酶活性應(yīng)該被進(jìn)一步分析，如α/β-淀粉酶、內(nèi)/外-1,4-β-葡聚糖酶、錳過氧化物酶、漆酶和果膠酶等。

紫陀螺菌潛在碳源代謝特征

為深入了解紫陀螺菌的營養(yǎng)代謝途徑，評估其人工栽培潛力。本試驗(yàn)集中研究了在不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)的紫陀螺菌的DEGs和DEPs，特別是那些參與木質(zhì)纖維素降解的DEGs和DEPs。結(jié)果表明，糖酵解/糖異生（ko00010）、丙酮酸代謝（ko00620）、乙醛酸和二甲羧酸代謝（ko00630）和TCA循環(huán)（ko00020）是主要的供能途徑。如果單糖（葡萄糖等）或寡糖（麥芽糖、蔗糖等）不足，多糖（淀粉、纖維素、果膠等）、氨基酸（色氨酸、蘇氨酸、酪氨酸等）和脂肪酸將是主要的碳源。在自然界中，降解多糖（淀粉、木質(zhì)纖維素等）的能力對真菌是十分重要的。淀粉是真菌在自然界中的重要碳源來源，一些外生菌根性真菌，如牛肝菌、乳菇等，顯示了利用淀粉作為生長基質(zhì)的能力。在本研究中，紫陀螺菌在葡萄糖缺失的情況下，淀粉和蔗糖代謝途徑中有6個上調(diào)基因和4個下調(diào)基因。盡管如此，紫陀螺菌大部分的DEGs都呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，尤其是在與能量供應(yīng)有關(guān)的TCA循環(huán)和與發(fā)育有關(guān)的蛋白酶體中。紫陀螺菌在B vs D比較組的轉(zhuǎn)錄調(diào)控表明淀粉不能成為紫陀螺菌生長發(fā)育的主要碳源。紫陀螺菌對木質(zhì)纖維素的降解也是本研究的焦點(diǎn)之一。首先，由內(nèi)切葡聚糖酶、1,4-β-纖維二糖苷酶和β-葡萄糖苷酶組成的纖維素酶主要降解植物中的纖維素。紫陀螺菌中19個相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)說明其可能具有一定降解纖維素的能力，特別是1,4-β-纖維二糖苷酶的存在，它可以特異性地水解1,4-β-D-糖苷鍵。對這些編碼纖維素酶的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行分析，B vs D組中有6個基因下調(diào)，表明充足的葡萄糖降低了紫陀螺菌對纖維素的利用。對半纖維素的降解，內(nèi)切-1,4-β-木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-葡萄糖苷酸酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶和α-L-阿拉伯糠醛苷酶等一系列酶扮演重要角色。然而，紫陀螺菌中僅發(fā)現(xiàn)8個編碼半纖維素酶的基因，包括1個編碼內(nèi)切-1,4-β-木聚糖酶、6個編碼阿魏酸酯酶、1個編碼α-阿拉伯呋喃糖苷酶的基因。與腐生真菌相比，紫陀螺菌中缺乏腐生真菌中常見的幾種關(guān)鍵酶，如β-木糖苷酶，α-葡萄糖苷酶，乙酰木聚糖酯酶等。而且半纖維素酶的低表達(dá)暗示紫陀螺菌可能難以從半纖維素中獲得碳源。紫陀螺菌中果膠酶種類和數(shù)量的分布也表明其對果膠具有有限的降解能力。與外生菌根真菌相似，紫陀螺菌中含有豐富的多銅氧化酶和錳過氧化物酶。然而編碼多銅氧化酶的基因數(shù)量與真菌生態(tài)位并不一致，因?yàn)樗鼈儚V泛存在于所有真菌中。況且在植物細(xì)胞壁組分木質(zhì)素的生物降解中起著核心作用的木質(zhì)素過氧化物酶的編碼基因并未被發(fā)現(xiàn)，這表明紫陀螺菌對木質(zhì)素的降解也很有限。

圖2 無外源添加條件下紫陀螺菌可能的碳源獲取途徑

Conclusion

本研究采用轉(zhuǎn)錄組和蛋白組技術(shù)聯(lián)合分析了四種培養(yǎng)基中紫陀螺菌菌絲生長期間的DEGs和DEPs表達(dá)情況。在缺乏葡萄糖的情況下，紫陀螺菌中涉及氨基酸（Try、Thr、Tyr、Gly、Ser、Arg、Pro、Val、Leu等）、淀粉、纖維素、木質(zhì)素、半纖維素、果膠以及部分脂肪酸降解的基因都轉(zhuǎn)錄表達(dá)，并在12個樣本中注釋出61個木質(zhì)纖維素降解表達(dá)基因，但DEGs和DEPs的差異富集暗示紫陀螺菌對淀粉、纖維素等大分子碳水化合物的降解有限。在蛋白胨缺乏的情況下，部分氨基酸（Ala、Phe、Arg、Pro、Try、Tyr等）代謝路徑中的相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，表明這些氨基酸可能是紫陀螺菌生長發(fā)育所必需。在添加了鮮馬鈴薯汁后，紫陀螺菌的DEGs和DEPs富集分析表明其生長需要一定的生長因子（growth factor），尤其是維生素（硫胺素、核黃素和維生素B6）和堿基（嘌呤、嘧啶）等。

01

第一作者

耿陽陽，男，理學(xué)博士，現(xiàn)為貴州省林業(yè)科學(xué)研究院副研究員，主要從事森林資源食品開發(fā)利用研究與應(yīng)用。工作以來，主持省科技廳、省林業(yè)局等各類科研項(xiàng)目5項(xiàng)，參與國家林草局、省科技廳、省林業(yè)局項(xiàng)目多項(xiàng)。以第一作者身份在中文核心及以上期刊發(fā)表文章10余篇，其中SCI收錄5篇，授權(quán)國家發(fā)明專利1項(xiàng)、實(shí)用新型專利1項(xiàng)。

02

通信作者

秦禮康，釀酒與食品工程學(xué)院副院長、教授、博士、博士生導(dǎo)師、學(xué)術(shù)學(xué)科帶頭人，兼任教育部食品科學(xué)與工程類專業(yè)教指委委員、省食安委委員、省法院知識產(chǎn)權(quán)審判咨詢專家等。主要從事特色油料高品質(zhì)制油及新產(chǎn)品延伸技術(shù)、優(yōu)勢雜糧雜豆主食化及高值化精深加工技術(shù)、特色發(fā)酵食品品質(zhì)提升及新產(chǎn)品開發(fā)技術(shù)、營養(yǎng)健康全谷物主食化新產(chǎn)品加工及保質(zhì)技術(shù)、食品安全控制及風(fēng)險評估等科研工作。先后主持國家、省、市各類課題及企業(yè)橫向項(xiàng)目80余項(xiàng)，經(jīng)費(fèi)2000多萬元，近五年發(fā)表學(xué)術(shù)論文70余篇（其中SCI收錄30余篇），授權(quán)國家發(fā)明專利10件，主編教材2部，專著2部。獲省科技進(jìn)步二等獎1項(xiàng)，三等獎1項(xiàng)。研究方向:主要從事雜糧雜豆?fàn)I養(yǎng)保健功能與新產(chǎn)品開發(fā)、淀粉植物和大宗糧油副產(chǎn)物及木本油料深加工增值與廢棄物處理、傳統(tǒng)特色發(fā)酵食品挖掘與工業(yè)化“瓶頸”關(guān)鍵技術(shù)研發(fā)、食品安全控制體系構(gòu)建以及風(fēng)險評估等糧油科學(xué)與工程領(lǐng)域方面的研究。

Transcriptome and proteome analysis reveals the characteristics of carbon metabolism in the mycelial development of Gomphus purpuraceus

Yangyang Genga,b,c, Shixin Zhangb,c, Yana Liub,c, Likang Qind,e,*

a Key Laboratory of Plant Resource Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region, Ministry of Education, College of Life Sciences/Institute of Agro-Bioengineering, Guizhou University, Guiyang 550025, China

b Guizhou Institute of Walnut, Guiyang 550025, China

c Guizhou Academy of Forestry, Guiyang 550025, China

d School of Liquor and Food Engineering, Guizhou University, Guiyang 550025, China

e Guizhou Industrial Technology Research Institute of Rare Edible and Medicinal Fungi Co., Ltd., Guiyang 550025, China

*Corresponding author.

Abstract

Gomphus purpuraceus is an ancient wild edible mushroom. However, the niche and lignocellulose degradation system of G. purpuraceus have remained cryptic. In the current study, transcriptome and proteome sequencing of G. purpuraceus in four mediums was performed. A total of 3489 differentially expressed genes (DEGs) and 891 differentially expressed proteins (DEPs) were screened out. For the lignocellulose degradation system, a total of 61 expressed genes were annotated, including 19 genes encoding cellulase, 8 genes encoding hemicellulase, 5 genes encoding pectinase, 22 genes encoding lignin oxidase, and 7 lignin degrading auxiliary enzyme. From two-omics, morphology, and enzyme activities, we speculated that G. purpuraceus might have a limited capacity to degrade polysaccharides (starch and lignocellulose). In addition, trace amount of fumonisins (FB1 and FB2) were found in the G. purpuraceus. These results provided a new perspective for understanding the key pathways and hub genes involved in carbon metabolism of G. purpuraceus development.

Reference:

GENG Y Y, ZHANG S X, LIU Y N, et al. Transcriptome and proteome analysis reveals the characteristics of carbon metabolism in the mycelial development of

Gomphus purpuraceus

本文編譯內(nèi)容由作者提供

編輯：梁安琪；責(zé)任編輯：孫勇

封面圖片：圖蟲創(chuàng)意