基于 CRISPR/Cas9 的全基因組系統(tǒng)性基因擾動(dòng)篩選，使研究者能夠在更廣闊的尺度和更高的分辨率下解析基因功能 ， 給 功能基因組學(xué)研究帶來(lái)了深刻變革。 目前廣泛應(yīng)用的 Pooled-CRISPR 篩選，通過(guò)將靶向特定基因或全基因組的 sgRNA 文庫(kù)導(dǎo)入細(xì)胞，構(gòu)建包含大量不同基因突變的細(xì)胞群體。隨后，研究者可以基于細(xì)胞存活率、增殖速度、藥物敏感性以及流式細(xì)胞分選結(jié)合熒光報(bào)告基因等易于量化的表型變化，對(duì)具有特定表型的細(xì)胞群體進(jìn)行富集和篩選，從而鑒定出調(diào)控 相關(guān) 表型的關(guān)鍵基因【1,2】。

盡管這類 Pooled-CRISPR 篩選方法在高通量、成本效益和實(shí)驗(yàn)可擴(kuò)展性方面具有顯著優(yōu)勢(shì)，但其在解析更 加 復(fù)雜 和 精細(xì)的細(xì)胞特征方面仍然受到限制。例如，與細(xì)胞器形態(tài)變化、亞細(xì)胞蛋白定位、細(xì)胞骨架動(dòng)態(tài)重塑等需要通過(guò)顯微鏡觀察分析的表型相關(guān)的基因，常常難以通過(guò)傳統(tǒng)的 Pooled-CRISPR 篩選直接捕獲。將 Pooled-CRISPR 篩選與顯微成像技術(shù)相結(jié)合在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析、成像通量等方面都面臨顯著挑戰(zhàn)。如何在保持大規(guī)模篩選能力的同時(shí)，提高成像解析度和表型分類能力，是當(dāng)前 CRISPR 功能基因組學(xué)向更深層次拓展時(shí)亟需解決的問(wèn)題。

針對(duì)上述局限， 近日， 耶魯大學(xué)David Breslow團(tuán)隊(duì) （ 第一作者為孫京波 ） 在Developmental Cell上發(fā)表了文章A microscopy-based CRISPR screening platform enables organellar functional genomics and illuminates ciliary biology，開發(fā)了一種新型篩選平臺(tái)，將pooled-CRISPR 基因擾動(dòng)與熒光顯微鏡表型分析相結(jié)合。該平臺(tái)利用商業(yè)化的顯微鏡硬件與軟件與基于定向光激活mCherry蛋白的pooled-CRISPR篩選策略相結(jié)合，通過(guò)對(duì)呈現(xiàn)特定表型的突變體細(xì)胞進(jìn)行光激活，使其能夠借助流式細(xì)胞儀（FACS）實(shí)現(xiàn)高效分選（圖1）。這一策略不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)復(fù)雜顯微表型的可擴(kuò)展篩選，也避免了對(duì)光學(xué)或編程方面的專業(yè)背景依賴，使平臺(tái)具備良好的可及性。 為了進(jìn)一步提升實(shí)驗(yàn)靈活性并拓寬可篩選表型的范圍，該團(tuán)隊(duì)建立了兩種互補(bǔ)的工作模式：（ 1 ）通過(guò)在活細(xì)胞中進(jìn)行遺傳篩選，可對(duì)細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)過(guò)程進(jìn)行時(shí)空分辨分析；（ 2 ）在固定細(xì)胞中結(jié)合抗體免疫標(biāo)記進(jìn)行篩選，從而拓展其在多種細(xì)胞結(jié)構(gòu)和分子標(biāo)志物中的適用性。這一設(shè)計(jì)使得平臺(tái)兼容活細(xì)胞及固定細(xì)胞分析，并能夠處理多種類型的細(xì)胞特征 。

基于這一自動(dòng)化、高通量且可擴(kuò)展的篩選 平臺(tái) ，該團(tuán)隊(duì)成功開展了全基因組和靶向性篩選，鑒定出多種已知及全新的纖毛調(diào)控因子【3】。進(jìn)一步，通過(guò)整合平行篩選結(jié)果，構(gòu)建了多維度的功能特征圖譜， 實(shí)現(xiàn)了對(duì)基因功能的精確映射 。通過(guò)對(duì)篩選獲得的候選基因 的 深入研究，該團(tuán)隊(duì)鑒定了調(diào)控纖毛 G 蛋白偶聯(lián)受體（ GPCR ）功能的關(guān)鍵因 子 EMC 復(fù)合體 ，該復(fù)合體 能夠特異性調(diào)控纖毛 GPCR (HTR6) 的定位，而不影響纖毛發(fā)生 （ ciliogenesis ） ，這一功能在 EMC5 和 EMC6 敲除細(xì)胞中得到了驗(yàn)證； 并 確認(rèn)了二吡啶酰胺化賴氨酸（ diphthamide ）生物合成通路在纖毛解體中的作用 。同時(shí)該團(tuán)隊(duì)還鑒定出 一種位于纖毛過(guò)渡區(qū)（transition zone, TZ）、對(duì)纖毛發(fā)生至關(guān)重要且具有進(jìn)化保守性的微 型 蛋白SMIM27 ， 進(jìn)一步的研究表明， SMIM27/ TZMP1 定位于纖毛過(guò)渡區(qū)（ transition zone ），并且 SMIM27/TZMP1 對(duì)人 體 細(xì)胞的纖毛形成及非洲爪蟾 （ Xenopus ） 胚胎纖毛功能的正常發(fā)揮均必不可少。

總體而言，該論文提供了一個(gè)功能強(qiáng)大、可廣泛應(yīng)用的技術(shù)與概念框架，證明基于顯微鏡的CRISPR篩選能夠系統(tǒng)性地將基因與細(xì)胞器表型關(guān)聯(lián)，并揭示新的生物學(xué)功能(圖2)【4】。 這些發(fā)現(xiàn)不僅深化了我們對(duì)纖毛結(jié)構(gòu)與功能調(diào)控機(jī)制的理解，也為纖毛疾病的治療提供了新的潛在解決途徑。

https://www.cell.com/developmental-cell/fulltext/S1534-5807(25)00666-5

制版人： 十一

參考文獻(xiàn)

1 Schraivogel, D., Steinmetz, L. M. & Parts, L. Pooled genome-scale CRISPR screens in single cells.

2 Shalem, O., Sanjana, N. E. & Zhang, F. High-throughput functional genomics using CRISPR–Cas9.Nature Reviews Genetics16, 299-311 (2015).

3 Breslow, D. K. et al. A CRISPR-based screen for Hedgehog signaling provides insights into ciliary function and ciliopathies.Nat Genet50, 460-471 (2018).

4 Sun, J., Ati?, I. S., Empke, S. L., Khokha, M. K. & Breslow, D. K. A microscopy-based CRISPR screening platform enables organellar functional genomics and illuminates ciliary biology.Dev. Cell(2025).

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