手足口病是一種重要的兒童傳染病。近年來，柯薩奇病毒A6型（CVA6）已成為手足口病最主要的病原體之一，并且常引發(fā)非典型癥狀或重癥，但尚無獲批的疫苗或藥物。此前研究已知CVA6利用KREMEN1（KRM1）受體感染細(xì)胞。然而KRM1在CVA6感染中的具體作用，以及是否存在其他CVA6受體，仍不清楚。

近期，上海市重大傳染病和生物安全研究院張超課題組與中國科學(xué)院武漢病毒研究所舒波課題組合作，在國際權(quán)威學(xué)術(shù)期刊《自然·通訊》（Nature Communications）上在線發(fā)表了題為“Molecular mechanisms of receptor recognition and antibody neutralization of coxsackievirus A6”的研究論文。該研究系統(tǒng)闡明了CVA6利用受體入侵宿主細(xì)胞的精細(xì)分子機(jī)制，首次揭示了其“雙受體入侵”的新模式，并成功研發(fā)出靶向全新位點(diǎn)、具有強(qiáng)中和活性的保護(hù)性抗體，為應(yīng)對(duì)CVA6感染提供了關(guān)鍵科學(xué)依據(jù)和潛在的干預(yù)策略。

本研究通過多重技術(shù)手段，取得了以下系列重要發(fā)現(xiàn):

01

KRM1可以誘導(dǎo)成熟CVA6病毒顆粒發(fā)生脫衣殼

研究首先通過功能實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)：宿主細(xì)胞敲除KRM1基因后，CVA6的感染滴度急劇下降36倍，直接證明了KRM1對(duì)于病毒復(fù)制不可或缺。緊接著，ELISA結(jié)合實(shí)驗(yàn)首次證明了CVA6病毒顆粒與KRM1蛋白之間劑量依賴性的直接結(jié)合，如同“鎖與鑰”的精確識(shí)別，為其功能提供了相互作用的實(shí)證。

最生動(dòng)的發(fā)現(xiàn)來自對(duì)病毒顆粒結(jié)構(gòu)的“觀測”。研究發(fā)現(xiàn)（圖1）：臨床分離的CVA6-HeB（河北株）毒株主要以構(gòu)象緊湊的成熟病毒顆粒（占比93%）形式存在，顛覆了以往認(rèn)為CVA6以膨脹的脫衣殼中間態(tài)（A顆粒）為主的認(rèn)知。然而，當(dāng)引入KRM1受體后，冷凍電鏡捕捉到了戲劇性的結(jié)構(gòu)重塑場景：在室溫、中性pH條件下，僅需35分鐘，KRM1便能高效驅(qū)動(dòng)成熟病毒顆粒發(fā)生轉(zhuǎn)化。原本占主導(dǎo)的成熟顆粒比例驟降至30%以下，而之前“缺席”的、處于脫衣殼中間狀態(tài)的A顆粒則從無到有，迅速成為占比70%的絕對(duì)主導(dǎo)群體。這一動(dòng)態(tài)過程清晰表明，A顆粒并非預(yù)先存在，而是成熟CVA6病毒顆粒在KRM1結(jié)合后主動(dòng)“解壓縮”的產(chǎn)物。病毒在受體作用下，像啟動(dòng)了預(yù)定的變形程序：衣殼膨脹、內(nèi)部穩(wěn)定病毒的“口袋因子”被排出、為RNA釋放打開通道。因此，KRM1是CVA6的高效的脫衣殼受體，負(fù)責(zé)誘導(dǎo)病毒變構(gòu)，有助于RNA釋放。

圖1. KRM1是CVA6病毒的高效的脫衣殼受體。

02

CVA6病毒入侵機(jī)制新發(fā)現(xiàn)：雙受體協(xié)同完成“附著”與“入侵”

本研究另一項(xiàng)重大突破在于完整揭示了CVA6入侵宿主細(xì)胞的精細(xì)“路線圖”。研究發(fā)現(xiàn)，該病毒采用了一種精妙的“兩步走”策略，依賴兩種不同的細(xì)胞受體接力完成感染。

鎖定“先遣隊(duì)”并驗(yàn)證其功能—硫酸乙酰肝素（HSPG）及其關(guān)鍵基因SLC35B2：基于功能推測，研究將目標(biāo)聚焦于細(xì)胞表面廣泛存在的硫酸乙酰肝素（HSPG）。為了驗(yàn)證其作用，研究團(tuán)隊(duì)瞄準(zhǔn)了負(fù)責(zé)HSPG硫酸化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)：SLC35B2基因。該基因編碼的蛋白負(fù)責(zé)將硫酸化底物轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體，是HSPG進(jìn)行硫酸化修飾、進(jìn)而發(fā)揮功能所必需的（圖2a）。通過敲除SLC35B2基因，可以破壞細(xì)胞表面HSPG的功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在SLC35B2敲除細(xì)胞上，CVA6的感染效率下降了35倍（圖2b），直接證明了硫酸化的HSPG對(duì)于CVA6感染至關(guān)重要。生化實(shí)驗(yàn)則直接“抓拍”到CVA6病毒顆粒與肝素（HSPG類似物）的特異性結(jié)合（圖2c）。

• 明確分工：雙受體各司其職。通過一系列精巧實(shí)驗(yàn)，兩個(gè)受體的職責(zé)被清晰界定：

• 附著階段：HSPG功能缺陷的細(xì)胞，病毒附著量銳減82%；而KRM1缺失則不影響附著（圖2d）。證明HSPG是核心的“吸附受體”，負(fù)責(zé)病毒初始錨定。

• 內(nèi)化階段：在KRM1缺失的細(xì)胞中，即使病毒正常附著，其進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的效率也驟降76%（圖2e）。證明KRM1是關(guān)鍵的“入侵執(zhí)行受體”，負(fù)責(zé)觸發(fā)病毒進(jìn)入和脫殼。

本研究首次闡明CVA6首先與細(xì)胞表面大量存在的硫酸化的HSPG結(jié)合，實(shí)現(xiàn)病毒初始粘附；隨后，病毒再與特異性更強(qiáng)的KRM1受體結(jié)合，后者啟動(dòng)病毒的細(xì)胞內(nèi)化和脫衣殼（圖2f）。這一“雙受體”模型的建立，為針對(duì)不同環(huán)節(jié)開發(fā)新型抗病毒策略奠定了關(guān)鍵理論基礎(chǔ)。

圖2. CVA6入侵的兩步模型：先依賴硫酸乙酰肝素附著，后由KRM1受體介導(dǎo)內(nèi)化。

03

高效保護(hù)性抗體的發(fā)現(xiàn)與中和機(jī)制

在闡明病毒入侵機(jī)制的同時(shí)，本研究成功篩選并鑒定出兩株具有卓越性能的CVA6特異性單克隆抗體——1F4與3H7，為未來防治提供了強(qiáng)有力的候選工具。

• “強(qiáng)效雙雄”1F4與3H7抗體的誕生與驗(yàn)證

研究團(tuán)隊(duì)通過用純化的CVA6病毒免疫小鼠，并經(jīng)過中和篩選，成功獲得了1F4和3H7兩株抗體。體外實(shí)驗(yàn)證明，它們對(duì)不同的CVA6毒株均表現(xiàn)出極強(qiáng)且特異的中和活性和結(jié)合活性（圖3a-b）。更為重要的是，在動(dòng)物攻毒實(shí)驗(yàn)中，這兩株抗體展現(xiàn)了極好的預(yù)防與治療雙重潛力。在致死劑量的病毒攻擊下，無論作為預(yù)防性用藥還是感染后24小時(shí)的治療性用藥，1F4和3H7均能有效保護(hù)新生小鼠，而對(duì)照組則全部死亡（圖3c）。這充分證明了它們在體內(nèi)對(duì)抗CVA6感染的強(qiáng)大能力。

• 生化機(jī)制分析：抗體阻斷病毒吸附后步驟

為了探明抗體究竟如何起作用，研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一項(xiàng)精巧的體外受體競爭實(shí)驗(yàn)。將純化的CVA6病毒顆粒固定，然后同時(shí)加入KRM1受體蛋白和不同的抗體。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，1F4和3H7抗體能顯著地阻擋KRM1蛋白與病毒結(jié)合（圖3d）。然而，接下來的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)揭示了更精妙的真相。當(dāng)用抗體預(yù)先處理病毒后再讓其接觸低溫下的細(xì)胞時(shí)，病毒的吸附細(xì)胞能力并未受到明顯影響（圖3e）。這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果清晰地描繪出抗體的精準(zhǔn)打擊策略：它們并不干預(yù)病毒在細(xì)胞表面的“停泊”（吸附），而是專精于阻止病毒完成入侵所必需的“內(nèi)部解鎖”（由KRM1介導(dǎo)的脫殼）。這一作用模式，恰好與KRM1受體本身的功能定位，不負(fù)責(zé)吸附，而是吸附后觸發(fā)脫衣殼的“開關(guān)”，完美契合。因此，1F4和3H7是在病毒入侵鏈條中最關(guān)鍵、最脆弱的第二步實(shí)施攔截。

• 冷凍電鏡解析了抗體的表位和作用機(jī)制

研究團(tuán)隊(duì)利用冷凍電鏡技術(shù)，成功解析了抗體與病毒復(fù)合物的高分辨率三維結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)分析顯示，1F4和3H7均結(jié)合在病毒衣殼一個(gè)全新的抗原表位上，該表位位于病毒顆粒的三倍軸附近，主要由VP1的C末端、VP3的AB環(huán)（又稱“ knob ”）等結(jié)構(gòu)元件構(gòu)成（圖3f-i）。這一發(fā)現(xiàn)打破了以往認(rèn)為CVA6病毒的五倍軸是主要中和靶點(diǎn)的認(rèn)知，揭示了一個(gè)此前未被重視的中和性抗原位點(diǎn)。

盡管結(jié)合位點(diǎn)相近，但兩種抗體的作用細(xì)節(jié)展現(xiàn)了精妙的差異與共性：1F4抗體特異性結(jié)合在成熟的病毒顆粒上，其輕鏈可變區(qū)（VL）與KRM1受體在空間上存在直接沖突，從物理上杜絕了受體靠近的可能（圖3f-g）。3H7抗體則展現(xiàn)了更強(qiáng)的適應(yīng)性與“粘性”。它不僅結(jié)合成熟病毒顆粒，也能結(jié)合空顆粒，表明其表位在病毒構(gòu)象變化后依然暴露（圖3h）。雖然3H7結(jié)合姿態(tài)對(duì)KRM1造成的直接空間位阻略小于1F4，但它通過更廣泛的相互作用界面（結(jié)合面積比1F4大33%）和極高的結(jié)合親和力（親和力是1F4的8.6倍），像“強(qiáng)力膠”一樣牢牢占據(jù)位點(diǎn)，持久性地阻斷受體（圖3i）。

圖3. CVA6高效保護(hù)性抗體1F4與3H7的發(fā)現(xiàn)與表征。

綜上所述，本研究首次完整闡明了CVA6采用“硫酸乙酰肝素附著-KRM1受體脫衣殼”的雙受體入侵模型，破解了其感染的關(guān)鍵起始步驟。KRM1作為專屬的脫衣殼受體，能高效誘導(dǎo)成熟病毒顆粒發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變，明確了其分子開關(guān)功能?；趯?duì)該入侵機(jī)制的深刻理解，本研究成功篩選出兩株高效中和抗體1F4與3H7。它們通過精準(zhǔn)競爭KRM1的結(jié)合位點(diǎn)，在病毒完成初始吸附后，特異地阻斷其內(nèi)化與脫衣殼過程，在動(dòng)物模型中展現(xiàn)出卓越的預(yù)防與治療效果。這項(xiàng)研究從機(jī)制解析到干預(yù)策略，為開發(fā)針對(duì)CVA6的疫苗和特效藥物奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，并提供了具有明確作用機(jī)制的候選抗體。

中國科學(xué)院武漢病毒研究所助理研究員柯賢良、上海市重大傳染病和生物安全研究院博士研究生李雪和劉則宇為本文共同第一作者。上海市重大傳染病和生物安全研究院青年研究員張超和武漢病毒研究所研究員舒波為本文共同通訊作者。該研究得到了中國疾控中心張勇研究員、中國科學(xué)院武漢病毒研究所龔鵬研究員、廈門大學(xué)程通教授、復(fù)旦大學(xué)章樹業(yè)研究員、湖北大學(xué)陳明周教授、吉林大學(xué)魏偉教授、浙江大學(xué)劉越研究員等人的幫助。該研究得到了國家自然科學(xué)基金、上海市市級(jí)科技重大專項(xiàng)、國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃等項(xiàng)目的資金支持。