2025年6月11日由奧胡斯大學(xué)Fulvio Reggiori團隊在《Science Advance》雜志上發(fā)表題為“Influenza A virus subverts the LC3-pericentrin dynein adaptor complex for host cytoplasm entry”的研究論文。

研究背景

甲型流感病毒（IAV）是一種重要的人類呼吸道病原體。其基因組包裹在病毒核糖核蛋白（vRNP）復(fù)合體中，該復(fù)合體進入細胞后，需通過“脫殼”將遺傳物質(zhì)釋放到細胞質(zhì)中，進而感染宿主。以往研究表明，IAV 可利用細胞內(nèi)“聚集小體加工機制”（APM），通過組蛋白去乙?；?（HDAC6）識別 vRNP 上的非錨定泛素鏈，進而驅(qū)動微管和肌球蛋白運動，促進病毒脫殼。此外，轉(zhuǎn)運蛋白TNPO1等因子也參與部分脫殼過程，但這些途徑被抑制后，病毒感染僅部分受損，暗示存在其他機制。本研究揭示了另一條關(guān)鍵通路：自噬相關(guān)蛋白 LC3 與 pericentrin（PCNT）形成銜接復(fù)合體，直接介導(dǎo) vRNP 與驅(qū)動蛋白dynein 1 的結(jié)合，從而在病毒進入細胞的內(nèi)體位置啟動脫殼。該機制與HDAC6依賴的APM通路并行，形成功能冗余，表明IAV已進化出兩種冗余策略來劫持動力蛋白分子馬達，以高效完成細胞質(zhì)入侵。

研究結(jié)果

結(jié)果1：

HDAC6并非介導(dǎo)IAV細胞質(zhì)入侵的唯一動力銜接蛋白

為揭示IAV利用細胞動力蛋白入侵細胞質(zhì)的具體途徑，作者首先利用siRNA技術(shù)分別抑制了宿主細胞內(nèi)的HDAC6（已知的病毒脫殼相關(guān)蛋白）和DYNC1I1（動力蛋白1的核心組分）。實驗結(jié)果表明，抑制HDAC6僅能使IAV的感染效率下降約50%，而抑制DYNC1I1則幾乎完全阻斷了病毒的復(fù)制。為進一步探究細胞骨架的作用進一步采用了藥物干預(yù)。發(fā)現(xiàn)單純解聚微管只能部分抑制IAV復(fù)制，而直接抑制動力蛋白功能或阻斷內(nèi)體酸化則能實現(xiàn)近90%的強烈抑制。尤為關(guān)鍵的是，當同時破壞微管和肌動蛋白時，其對病毒復(fù)制的抑制效果與直接靶向動力蛋白相當，這說明IAV所利用的動力蛋白系統(tǒng)需要這兩種細胞骨架網(wǎng)絡(luò)的協(xié)同配合。此外，研究還證實這種依賴具有病毒特異性，并非所有病毒都同樣需要此通路。在細胞質(zhì)入侵的實驗中，作者發(fā)現(xiàn)，當DYNC1I1被抑制后，病毒蛋白M1幾乎完全被禁錮在內(nèi)體結(jié)構(gòu)中無法釋放；而HDAC6被抑制時，僅出現(xiàn)部分滯留。這為DYNC1I1是病毒實現(xiàn)細胞質(zhì)入侵的關(guān)鍵樞紐提供了最直觀的證據(jù)，并最終確證：HDAC6并非IAV用以連接并利用動力蛋白系統(tǒng)的唯一適配器。

果2：LC3蛋白而非完整自噬機制對IAV感染至關(guān)重要

為探究IAV如何利用動力蛋白，作者首先利用基因敲除細胞系發(fā)現(xiàn)，缺失全部三種LC3蛋白（LC3A/B/C）會顯著抑制IAV感染，而缺失另一亞家族GABARAPs則無影響，這表明LC3s在IAV感染中具有獨特且關(guān)鍵的作用。進一步實驗表明，三種LC3異構(gòu)體在功能上存在冗余，任一成員均能恢復(fù)LC3缺失細胞中的病毒感染能力。為研究其是否依賴于經(jīng)典自噬途徑，作者在缺失自噬關(guān)鍵蛋白（如ATG7、ATG13或ATG16L1）的細胞發(fā)現(xiàn)自噬核心蛋白的缺失并不影響病毒復(fù)制，證明LC3s促進IAV感染的功能獨立于完整的自噬機制。更重要的是，研究人員構(gòu)建了多種LC3B突變體，發(fā)現(xiàn)即使是被改造為無法進行脂化的LC3B變體，也同樣能有效支持IAV感染。這最終證實，LC3s是通過其非脂化的“I型”形式，以一種不依賴于自噬的全新機制，在IAV感染周期中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

結(jié)果3：LC3促進IAV從LAMP1陽性晚期內(nèi)體脫殼

本研究進一步探究了LC3s在IAV感染周期中的具體作用環(huán)節(jié)。通過細胞質(zhì)入侵實驗發(fā)現(xiàn)，在缺失所有LC3s的細胞中，病毒的M1蛋白幾乎全部以點狀結(jié)構(gòu)被困于細胞內(nèi)，其狀況與使用藥物抑制內(nèi)體酸化的效果類似。共定位分析發(fā)現(xiàn)，M1主要與晚期內(nèi)體標志物L(fēng)AMP1結(jié)合，與早期內(nèi)體標志物SNX1幾乎無共定位，且共定位程度高于正常細胞，表明LC3缺失導(dǎo)致IAV被困于晚期內(nèi)體。此外，作者還排除了LC3s影響其他早期步驟的可能性，發(fā)現(xiàn)病毒與細胞表面的結(jié)合以及其內(nèi)吞過程在LC3s缺失的細胞中均未受影響。同時，其他依賴低pH內(nèi)體環(huán)境入侵的病毒（如HSV-1和VaV）在LC3s缺失細胞中的感染依然正常，這表明LC3s的缺失并未造成普遍的內(nèi)體功能缺陷，其對IAV感染的抑制是特異性的。

結(jié)果4：LC3在IAV細胞質(zhì)入侵過程中與vRNP及動力蛋白1相互作用

為闡明LC3s分子層面的作用機制，作者通過免疫熒光發(fā)現(xiàn)，在IAV感染過程中，部分LC3斑點與病毒M1蛋白共定位，而使用Baf抑制內(nèi)體酸化則會顯著減少此共定位，證明LC3s被特異性招募至病毒vRNPs釋放的位點。同時，LC3還能與動力蛋白1亞基DYNC1I1結(jié)合，且結(jié)合具有特異性-參與自噬體轉(zhuǎn)運的驅(qū)動蛋白KIF5B未在共沉淀產(chǎn)物中檢出，LC3也不與HDAC6結(jié)合，這些結(jié)果表明，在IAV細胞質(zhì)入侵過程中，LC3可作為橋梁，同時結(jié)合vRNP與動力蛋白1，且該相互作用獨立于HDAC6介導(dǎo)的聚集體處理機制，形成一條新的動力蛋白銜接途徑，為vRNP借助動力蛋白實現(xiàn)細胞質(zhì)入侵提供直接分子連接。

結(jié)果5：動力蛋白銜接蛋白PCNT是IAV細胞質(zhì)入侵的必需因子

本研究旨在揭示連接LC3s與動力蛋白1（Dynein 1）的關(guān)鍵適配器蛋白。通過在感染IAV的細胞中進行LC3免疫共沉淀及質(zhì)譜分析，研究人員鑒定出15個已知能與動力蛋白相互作用的候選蛋白。隨后，通過siRNA逐一敲低這些候選基因并進行功能篩選，發(fā)現(xiàn)其中PCNT（ pericentrin ）的缺失能顯著抑制IAV復(fù)制。進一步的細胞質(zhì)進入實驗證實，敲低PCNT會特異性地阻礙病毒顆粒在內(nèi)體中的脫殼過程，導(dǎo)致病毒M1蛋白更多地滯留于晚期內(nèi)體/溶酶體中，但其滯留程度弱于直接敲低動力蛋白亞基DYNC1I1，提示PCNT在此過程中起部分作用。此外，PCNT的缺失并不影響病毒對細胞的附著與內(nèi)吞，也不影響其他病毒（如HSV-1和VaV）的感染，表明其功能具有IAV特異性。

結(jié)果6：IAV感染不依賴于PCNT在中心體組裝中的作用

為探究PCNT蛋白在IAV感染中的具體作用機制，首先，研究人員使用藥物抑制中心體組裝，發(fā)現(xiàn)這確實會顯著抑制IAV感染，提示中心體結(jié)構(gòu)可能與病毒感染有關(guān)。然而，PCNT存在兩種剪接異構(gòu)體（PCNTS和PCNTB），實驗證明兩者均能有效恢復(fù)PCNT缺失細胞中的IAV感染能力，表明它們在功能上具有冗余性。為了直接檢驗PCNT的病毒相關(guān)功能是否依賴于其定位至中心體的能力，研究人員構(gòu)建了缺失PACT結(jié)構(gòu)域的PCNT突變體。令人意外的是，即使無法定位到中心體，這種突變體依然能夠有效支持IAV感染。此外，研究還證實，敲低PCNT、LC3s或動力蛋白亞基DYNC1I1，并不會影響微管網(wǎng)絡(luò)或中心粒的正常組織結(jié)構(gòu)，排除了因細胞結(jié)構(gòu)破壞間接影響病毒感染的潛在可能。這些結(jié)果表明PCNT在促進IAV感染過程中的功能是獨立于其在中心體組裝中的經(jīng)典作用的。

結(jié)果7：LC3與PCNT形成介導(dǎo)IAV細胞質(zhì)入侵的動力蛋白銜接復(fù)合物

本研究最終闡明了LC3s與PCNT在IAV脫殼過程中的協(xié)同作用機制?；蚯玫蛯嶒烇@示，同時沉默PCNT和LC3s對病毒感染的抑制效果并未疊加，表明二者作用于同一通路。反之，同時沉默PCNT和HDAC6則能強烈抑制感染，效果與直接敲低動力蛋白亞基DYNC1I1相當，這確證了PCNT/LC3和HDAC6是兩條獨立且功能冗余的動力蛋白依賴通路。這種機制在不同IAV亞型中存在差異：H1N1和H5N1同時利用這兩條通路，而H3N2主要依賴LC3-PCNT模塊，提示病毒亞型演化出了不同的細胞質(zhì)入侵策。為了確定 PCNT 是否是促進 IAV 與 LC3 一起脫衣的動力蛋白 1 接頭，我們在耗盡 PCNT 的 atg7?/? 細胞中使用 LC3 抗體進行了IP，發(fā)現(xiàn)病毒vRNP與LC3s結(jié)合，而PCNT作為關(guān)鍵銜接橋，一端與LC3s（進而間接連接vRNP）關(guān)聯(lián)，另一端直接結(jié)合動力蛋白亞基DYNC1I1。值得注意的是，PCNT的缺失并不影響LC3s被招募至病毒所在的內(nèi)體，但會導(dǎo)致LC3s與病毒蛋白在內(nèi)體上的滯留增加。這些數(shù)據(jù)揭示了LC3s和PCNT形成了一個獨立的動力蛋白適配器復(fù)合物，該復(fù)合物與HDAC6通路并行，共同介導(dǎo)病毒顆粒在內(nèi)體上的脫殼及其后續(xù)的細胞質(zhì)侵入。

本研究首次揭示了一條全新的、獨立的脫殼機制：自噬蛋白LC3s與中心體蛋白PCNT在內(nèi)體上形成一個銜接復(fù)合體，該復(fù)合體能直接“挾持”細胞內(nèi)的動力蛋白（Dynein 1），從而將病毒基因組成功“拽”入細胞質(zhì)。尤為重要的是，LC3s和PCNT在此過程中的功能完全獨立于它們已知的自噬和中心體組裝功能。當同時抑制這條新通路和已知的APM通路時，對病毒感染的抑制作用最強，證明IAV進化出了兩條功能冗余的“雙保險”策略來劫持宿主細胞的動力系統(tǒng)，以確保其成功入侵。這項研究極大地深化了我們對流感病毒生命周期的理解，并為開發(fā)針對病毒入侵環(huán)節(jié)的新型廣譜抗病毒策略提供了全新的潛在靶點。

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40498831/

DOI:10.1126/sciadv.adu7602

來源：ZhaoSunLab

編輯：吃一口小貓