導(dǎo)語

【 目的 】 水是維持生命活動(dòng)的關(guān)鍵物質(zhì)基礎(chǔ)，其質(zhì)量直接影響生態(tài)平衡與人類健康。水源受致病微生物污染引起的水源性疾病嚴(yán)重威脅全球公共衛(wèi)生安全，因此，快速準(zhǔn)確檢測致病微生物對(duì)水質(zhì)安全至關(guān)重要?！?方法 】 文章綜述熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative PCR,qPCR)在水源性致病微生物檢測中的應(yīng)用，整合qPCR技術(shù)在水源性致病微生物檢測中的關(guān)鍵案例與試驗(yàn)數(shù)據(jù),探討其技術(shù)優(yōu)勢(shì)、現(xiàn)存挑戰(zhàn)及未來發(fā)展方向，為水質(zhì)安全檢測提供理論支持。 【 結(jié)果 】 qPCR基于熒光信號(hào)動(dòng)態(tài)監(jiān)測與循環(huán)閾值 ( C t ) 定量分析，顯著提升水源性致病微生物檢測的靈敏度和檢測速度。在細(xì)菌檢測中，qPCR可以對(duì)靶向細(xì)菌特異性基因?qū)崿F(xiàn)快速定量；對(duì)病毒及原蟲可以縮短檢測周期同時(shí)提升通量。并且該方法適用于飲用水、廢水及娛樂用水等不同水體的水質(zhì)檢測，但面臨區(qū)分活菌、死菌，應(yīng)對(duì)抑制劑干擾以及優(yōu)化引物設(shè)計(jì)等挑戰(zhàn)。 【 結(jié)論 】 qPCR憑借高靈敏、檢測快速及適應(yīng)性廣的優(yōu)勢(shì)，成為水質(zhì)安全檢測的核心工具。新興技術(shù)進(jìn)一步提升了檢測精度與效率，數(shù)字PCR(dPCR)無需標(biāo)準(zhǔn)曲線即可實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量，多重qPCR(mPCR)通過多靶標(biāo)同步分析進(jìn)一步降低檢測成本。未來需要推動(dòng)多技術(shù)聯(lián)用、開發(fā)自動(dòng)化檢測平臺(tái)及制定國際標(biāo)準(zhǔn)化操作流程，以應(yīng)對(duì)復(fù)雜水體環(huán)境的大規(guī)模檢測需求，為全球水安全提供更高效的技術(shù)支撐。

【引文格式】

張星宇, 周婉婷, 邢方瀟, 等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR 在水源性致病微生物檢測中的應(yīng)用[J].凈水技術(shù), 2025, 44(9): 10-20.

ZHANG X Y, ZHOU W T, XING F X, et al.Application of real-time quantitative PCR in determination of water-borne pathogenic microorganisms[J]. Water Purification Technology, 2025, 44(9): 10-20.

通信作者

張嵐

中國疾病預(yù)防控制中心環(huán)境所水質(zhì)量與健康監(jiān)測室主任、研究員/《凈水技術(shù)》期刊編委

中國營養(yǎng)學(xué)會(huì)飲水與健康分會(huì)副主任委員,中華預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)衛(wèi)生檢驗(yàn)專業(yè)委員會(huì)副主任委員,中國地理學(xué)會(huì)醫(yī)學(xué)地理專業(yè)委員會(huì)副主任委員,中國學(xué)生營養(yǎng)與健康促進(jìn)會(huì)學(xué)校飲水與環(huán)境健康分會(huì)副主任委員,中華醫(yī)學(xué)會(huì)地方病學(xué)分會(huì)常務(wù)委員,北京理化分析測試學(xué)會(huì)副理事長,第八屆國家學(xué)校衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)化專業(yè)委員會(huì)委員,第二屆全國飲料標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)委員,國家健康科普專家?guī)斐蓡T,涉水產(chǎn)品評(píng)審專家。從事飲水與健康、飲水檢驗(yàn)技術(shù)、消毒技術(shù)等方面研究工作。主持/參與《飲用天然礦泉水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法》《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法》等多項(xiàng)國家標(biāo)準(zhǔn),主持/參與多項(xiàng)國家科技重大專項(xiàng)、重點(diǎn)研發(fā)、科技支撐項(xiàng)目;負(fù)責(zé)“全國飲用水中抗生素、全氟化合物、高氯酸鹽、鹵代苯醌、微塑料等新污染物地理分布特征及健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估”“國家城市飲用水衛(wèi)生監(jiān)測”“全國城市供水水質(zhì)普查”等全國性項(xiàng)目的運(yùn)行及技術(shù)支撐;參與《全國城市飲用水衛(wèi)生安全保障規(guī)劃》等國家規(guī)劃的編制。獲得國家科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)等各類科技獎(jiǎng)項(xiàng)7項(xiàng),發(fā)表論文200余篇,主編/參編書籍10余本。

水是地球上生命得以延續(xù)的最重要的自然資源之一，水質(zhì)安全直接關(guān)系到全球公共衛(wèi)生。水中的微生物如細(xì)菌、病毒和原蟲等致病微生物是介水傳染病傳播的重要因素，并且水源性致病微生物已在淡水、生活用水及娛樂用水等水體中檢出。水源性疾病在世界范圍內(nèi)已造成嚴(yán)重的發(fā)病率和死亡率，成為重要的公共衛(wèi)生問題。在美國，水源性致病微生物(包括13種細(xì)菌、1種病毒和2種原蟲)導(dǎo)致每年約715萬人患病，11.8萬人住院治療，6630人死亡，直接醫(yī)療保健費(fèi)用為3.33億美元。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)估計(jì)每年約有443832名5歲以下兒童以及50851名5～9歲兒童死于腹瀉，腹瀉疾病多數(shù)是由糞便污染的水源所導(dǎo)致。為緩解這一公共衛(wèi)生事件造成的影響，WHO、美國環(huán)保署(EPA)、歐盟、我國以及其他相關(guān)國家制定了水源性致病微生物的具體衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)限值。

目前，水源性致病微生物的檢測主要以選擇性培養(yǎng)和濾膜法、多管發(fā)酵法及免疫磁分離熒光抗體法等標(biāo)準(zhǔn)生化方法為主。在選擇性培養(yǎng)過程中可能會(huì)出現(xiàn)菌落的缺失，存在進(jìn)入活的但不可培養(yǎng)(viable but non-cultureable,VBNC)狀態(tài)的細(xì)胞。傳統(tǒng)方法還存在檢測到的細(xì)胞種類無法精確定位的問題，如濾膜法需借助血清學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定來確定細(xì)胞種類，多管發(fā)酵法要通過革蘭氏染色及鏡檢和生化鑒定試驗(yàn)明確細(xì)胞種類，額外步驟增加了檢測的復(fù)雜性和工作量。此外，傳統(tǒng)方法非常耗時(shí)，像大腸埃希氏菌使用傳統(tǒng)濾膜過濾培養(yǎng)和生化鑒定需48～72h，諾如病毒用細(xì)胞培養(yǎng)聯(lián)合電鏡檢查需要2～4周，賈第鞭毛蟲使用免疫熒光染色鏡檢方法需24h以內(nèi)的時(shí)間。分子檢測技術(shù)的引入，改善和簡化了環(huán)境中微生物的檢測和鑒定。自1985年，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)作為應(yīng)用最廣泛的核酸擴(kuò)增方法，在微生物的鑒定中發(fā)揮了重要作用，它克服了傳統(tǒng)方法檢測速度慢等問題，實(shí)現(xiàn)了對(duì)特定核酸的快速擴(kuò)增。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展而來的定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative PCR,qPCR)展現(xiàn)出了更多優(yōu)勢(shì)。研究表明，qPCR不僅檢測速度快，還具有靈敏度、準(zhǔn)確度、特異性高，動(dòng)態(tài)范圍寬和適用范圍廣等特點(diǎn)，該方法適用于水源性致病微生物特異性遺傳標(biāo)記的定量測定，為水源性致病微生物檢測提供了更高效、可靠的手段。文章系統(tǒng)總結(jié)了qPCR在水源性致病微生物檢測中的應(yīng)用，綜述其原理、挑戰(zhàn)及未來發(fā)展方向。

1 q-PCR技術(shù)原理與檢測流程

qPCR是一種通過實(shí)時(shí)監(jiān)測脫氧核糖核酸(DNA)擴(kuò)增過程中熒光信號(hào)積累以實(shí)現(xiàn)核酸定量的分子技術(shù)，其核心在于熒光標(biāo)記物與擴(kuò)增產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)。與傳統(tǒng)PCR相比，qPCR通過引入熒光染料(如SYBR Green I)或序列特異性探針(如TaqMan探針),可在每個(gè)循環(huán)中直接捕獲DNA合成量，從而建立初始模板濃度與擴(kuò)增曲線循環(huán)閾值(Ct)的對(duì)數(shù)線性關(guān)系。Ferdous等通過靶向霍亂弧菌的

ctx

A 基因構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，證實(shí) C t 值與模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)呈高度線性相關(guān)；Jothikumar等 基于18S rDNA開發(fā)了一種TaqMan qPCR方法結(jié)合測序技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)賈第鞭毛蟲的高靈敏檢測和物種精準(zhǔn)鑒定。qPCR的定量能力不僅限于DNA目標(biāo)物，定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse-transcription PCR,RT-qPCR)通過整合逆轉(zhuǎn)錄步驟，利用逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA病毒轉(zhuǎn)化為互補(bǔ)DNA(cDNA)后進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)對(duì)RNA病毒的精準(zhǔn)檢測，被廣泛應(yīng)用于水體中RNA病毒的檢測 。

qPCR檢測水源性致病微生物主要包括樣本預(yù)處理(如濾膜富集低豐度病原體、離心去除顆粒物)、核酸提取與純化、引物/探針設(shè)計(jì)、擴(kuò)增及數(shù)據(jù)分析5個(gè)環(huán)節(jié)。針對(duì)RNA病毒，需額外增加逆轉(zhuǎn)錄步驟生成cDNA，并優(yōu)化RNA保護(hù)策略。擴(kuò)增曲線分析需關(guān)注基線期、指數(shù)期與平臺(tái)期三階段，閾值通常設(shè)定為基線熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)差的10倍，以規(guī)避背景噪聲對(duì)Ct值判讀的干擾。圖1為qPCR檢測流程圖。

圖1 qPCR檢測流程

2 q-PCR 在水源性致病微生物檢測中的應(yīng)用

2.1

常見水源性致病微生物檢測

隨著水傳播疾病風(fēng)險(xiǎn)的增加，qPCR技術(shù)憑借其高靈敏度和快速檢測能力，被廣泛應(yīng)用于檢測水體中細(xì)菌、病毒和原蟲。

2.1.1 細(xì)菌

水體中致病細(xì)菌是引發(fā)腹瀉、霍亂、痢疾及皮膚和組織感染等疾病的主要病原體。根據(jù)《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 第12部分:微生物指標(biāo)》(GB/T 5750.12—2023)，生活飲用水中的微生物主要通過培養(yǎng)法檢測，《飲用水中軍團(tuán)菌檢測》(SN/T 2528—2010)規(guī)定，飲用水中軍團(tuán)菌的主要檢測方法包括培養(yǎng)法、分子生物學(xué)技術(shù)及血清學(xué)鑒定。傳統(tǒng)方法雖可靠性高，但耗時(shí)較長，難以滿足快速檢測需要。qPCR可以通過靶向種屬特異性基因?qū)崿F(xiàn)快速定量，顯著縮短檢測時(shí)間。Walker等開發(fā)的ybbW基因qPCR法可在6 h內(nèi)完成檢測，對(duì)大腸氏埃希菌的特異度和靈敏度達(dá)100%。為提高低豐度菌檢出率，超濾或免疫磁珠分離可將檢測靈敏度提升10～100倍；Wu等通過超濾qPCR聯(lián)用技術(shù)，在4～8 h內(nèi)完成廢水中沙門氏菌的檢測。

2.1.2 病毒

水傳播腸道病毒因其體積小、感染劑量低及環(huán)境抗性強(qiáng)，對(duì)人類健康構(gòu)成威脅。雙鏈DNA(dsDNA)病毒因DNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較強(qiáng)，可在水體中存活數(shù)周；單鏈DNA(ssRNA)通過頻繁的基因重組可以維持高傳染性。無包膜病毒因?yàn)槿狈χ|(zhì)外層，對(duì)氯消毒的抗性高于包膜病毒，增加了處理難度?，F(xiàn)行檢測方法

EPA

Method

1615

使用培養(yǎng)法檢測病毒，該方法能特異性識(shí)別感染性病毒顆粒，但檢測周期長，對(duì)病毒載量要求高，難以檢測諾如病毒等無法在常規(guī)細(xì)胞系中增殖的病原體 。分子生物學(xué)技術(shù)提高了病毒檢測效率與靈敏度，對(duì)于dsDNA病毒，qPCR對(duì)可靶向保守區(qū)基因檢出環(huán)境樣本中的低載量病毒； 對(duì)于ssRNA病毒采用RT-qPCR結(jié)合特異性探針將檢測周期縮短至5 h，突破傳統(tǒng)培養(yǎng)法對(duì)病毒活性的依賴 。Bennett等 開發(fā)的多重實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(multiplex quantitative real-time polymerase chain reaction,mqPCR)體系可同步分析腺病毒、星狀病毒及輪狀病毒，在保持與單重qPCR相當(dāng)?shù)撵`敏度和特異性的同時(shí)，降低了試劑成本并減少了樣本消耗量 。但多重檢測需優(yōu)化引物探針組合以避免交叉反應(yīng)，且設(shè)備通道數(shù)限制檢測維度，超高通量需求仍需依賴數(shù)字PCR(dPCR)或測序技術(shù)補(bǔ)充。

2.1.3 原蟲

隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲是引發(fā)人體腹瀉以及水源性疾病暴發(fā)的常見病原體。現(xiàn)行檢測方法

EPA

Method

1622

中主要使用免疫磁分離和免疫熒光檢測，雖然該方法有較高的靈敏度和特異度，但操作復(fù)雜且耗時(shí)。Moreno-Mesonero等 使用qPCR結(jié)合18S rRNA測序檢測到廢水中極低濃度的原蟲DNA，可以在數(shù)小時(shí)內(nèi)完成。Duan等 開發(fā)了一種針對(duì)19種水源性原蟲和3種水源性蠕蟲的高通量定量聚合酶鏈反應(yīng)(high-throughput quantitative PCR,HT-qPCR)測定法，該方法解決了現(xiàn)有診斷方法通量低的局限性，同時(shí)提高了準(zhǔn)確性，3 h內(nèi)可對(duì)多達(dá)192個(gè)樣本中的22個(gè)目標(biāo)進(jìn)行分析，這種快速的數(shù)據(jù)生成對(duì)于大規(guī)模檢測和初步篩查具有優(yōu)勢(shì)，有助于后續(xù)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

2.1.4 小結(jié)

使用qPCR檢測水源性致病微生物的優(yōu)點(diǎn)是檢測的靈敏度與檢測效率高，檢測周期短，使用聯(lián)用技術(shù)可實(shí)現(xiàn)高通量檢測。該方法的局限性在于無法有效區(qū)分活菌、死菌，易受復(fù)雜基質(zhì)中抑制劑干擾以及引物設(shè)計(jì)冗余或脫靶風(fēng)險(xiǎn)等。表1為常見水源性致病微生物檢測方法的比較。

表1 常見水源性致病微生物檢測方法比較

2.2

不同水體環(huán)境中的應(yīng)用

2.2.1 飲用水

飲用水中存在的致病微生物可能是通過水源污染、水廠消毒不徹底或管網(wǎng)二次污染等途徑進(jìn)入供水系統(tǒng)引發(fā)水源性疾病。qPCR通過特異性引物或探針，可在4～6 h內(nèi)實(shí)現(xiàn)病原體絕對(duì)定量，靈敏度較傳統(tǒng)方法提升1～2個(gè)數(shù)量級(jí)。Wang等證實(shí)qPCR對(duì)銅綠假單胞菌檢出限低至2 CFU/L。使用RT-qPCR或qPCR結(jié)合免疫磁珠富集可將輪狀病毒和賈第鞭毛蟲檢測周期從數(shù)周縮短至5 h。在實(shí)際應(yīng)用中，飲用水中的雜質(zhì)，如腐植酸、金屬離子等，可能會(huì)抑制PCR反應(yīng)；飲用水余氯消毒可能降解病原體DNA，導(dǎo)致qPCR假陰性。研究人員需要采用合適的核酸提取方法，去除雜質(zhì)的干擾，同時(shí)優(yōu)化PCR反應(yīng)體系，提高反應(yīng)的穩(wěn)定性。

2.2.2 廢水與污水處理廠

廢水與污水處理廠是水源性致病微生物檢測的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，其進(jìn)水主要來源于生活污水、醫(yī)療廢水、農(nóng)業(yè)徑流及工業(yè)排放，攜帶細(xì)菌、病毒、原蟲等多類病原體。Wang等使用qPCR檢測瑞典哥德堡Rya污水處理廠檢出出水中諾如病毒GⅡ型高達(dá)1×105 L-1,而傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)法因病毒失活無法檢出。針對(duì)隱孢子蟲等原蟲，qPCR結(jié)合免疫磁珠富集將檢測限降至1 oocysts/(10 L)，較傳統(tǒng)顯微鏡法靈敏度提升100倍。 腐植酸、重金屬及多酚類物質(zhì)等污水復(fù)雜基質(zhì)可抑制qPCR擴(kuò)增效率，需通過硅膠膜純化或添加聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone,PVP)改善；病毒基因組重組可能導(dǎo)致引物脫靶，需定期更新靶標(biāo)設(shè)計(jì)。Maestre-Carballa等比較了dPCR和qPCR發(fā)現(xiàn)，dPCR可以估計(jì)拷貝基因的絕對(duì)豐度，通過微滴分區(qū)實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量，有更高的靈敏度和精密度，以及更好的抗抑制劑能力，并且無需校準(zhǔn)曲線。

2.2.3 其他水體

除飲用水與廢水外，海水及娛樂用水同樣是水源性致病微生物傳播的重要媒介。 Saleem等使用qPCR檢測娛樂用水中的腸球菌，檢測時(shí)間縮短至3.5～4.0 h，并且降低檢測結(jié)果為假陽性的概率。An等開發(fā)并驗(yàn)證了一種高靈敏度和高特異性HT-qPCR方法，能夠同時(shí)對(duì)33種人類病原體的68個(gè)標(biāo)記基因以及10種宿主的23種糞便標(biāo)記物進(jìn)行定量分析并成功應(yīng)用于我國廈門海洋娛樂用水樣本中病原體和糞便污染情況的調(diào)查。

2.2.4 小結(jié)

qPCR在檢測不同水體環(huán)境時(shí)，具有高靈敏度和高特異性，顯著提升水源性致病微生物的檢測效率。其局限性在于易受復(fù)雜基質(zhì)干擾、需定期更換引物等。改進(jìn)方向可以結(jié)合dPCR提升抗干擾能力與絕對(duì)定量精度，優(yōu)化核酸提取流程，如硅膠膜純化，以及推動(dòng)標(biāo)準(zhǔn)化操作以增強(qiáng)不同實(shí)驗(yàn)室的檢測可比性與可靠性。表2為不同水體中水源性致病微生物檢測技術(shù)的比較。

表2 不同水體中水源性致病微生物檢測技術(shù)比較

3 技術(shù)挑戰(zhàn)與優(yōu)化策略

3.1

活菌與死菌的區(qū)分

已證明單疊氮化丙啶(propidium monoazide bromide,PMA)和qPCR的組合可有效定量各種微生物中的活細(xì)菌 。PMA基于膜完整性的選擇性染色來檢測活細(xì)胞,可以從死細(xì)胞的DNA擴(kuò)增中排除假陽性 。Deshmukh等 評(píng)估了PMA-qPCR從死細(xì)胞中區(qū)分活的大腸桿菌O157:H7和大腸桿菌MTCC 3221菌株的潛力，結(jié)果表明死細(xì)胞的DNA擴(kuò)增幾乎完全被抑制，并且PMA-qPCR測定能夠檢測低至7 fg大腸桿菌DNA。

3.2

抑制劑干擾與靈敏度提升

環(huán)境樣品中存在的腐植酸、黃腐酸、酚類化合物、重金屬和螯合劑等抑制劑會(huì)對(duì)qPCR產(chǎn)生干擾并降低檢測的靈敏度。解決抑制問題是防止定量水平降低和減少假陰性的關(guān)鍵。評(píng)估目標(biāo)基質(zhì)中是否存在抑制劑，可以進(jìn)行內(nèi)部或外部擴(kuò)增對(duì)照或稀釋曲線。EPA推薦的常用外源DNA對(duì)照是鮭魚睪丸DNA，它需要加標(biāo)已知濃度的外源DNA靶標(biāo)量化豐度，確定抑制對(duì)檢測和定量的影響程度。Cao等使用qPCR檢測環(huán)境水樣中的腸球菌時(shí)沒有準(zhǔn)確量化抑制因素，導(dǎo)致目標(biāo)報(bào)告不準(zhǔn)確。根據(jù)DNA提取物中靶基因拷貝的預(yù)期變異性和豐度，可針對(duì)樣品的一個(gè)子集或者全部樣品來開展稀釋曲線的繪制工作。如果抑制起作用，可以選擇最佳稀釋度，也可以在qPCR反應(yīng)中添加蛋白酶抑制劑、甲酰胺或牛血清白蛋白等補(bǔ)充劑增強(qiáng)擴(kuò)增。

3.3

引物設(shè)計(jì)與假陽性控制

確保qPCR檢測成功需驗(yàn)證引物以及標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)確性，還要依據(jù)參考文獻(xiàn) 對(duì)檢測性能進(jìn)行優(yōu)化。參數(shù)沒有得到足夠優(yōu)化可能導(dǎo)致靶標(biāo)的非特異性擴(kuò)增或定量不足，從而導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確 。為了在qPCR分析過程中獲得特定靶基因，提高測量的準(zhǔn)確性，正確設(shè)計(jì)相應(yīng)引物是重要因素 。Perez-Bou等 用計(jì)算機(jī)模擬方式設(shè)計(jì)了1對(duì)靶向 aadA 、 aadB 、 ampC 、 bla SHV 、 bla TEM 、 dfrA 1、 ermB 、 fosA 、 mecA 、 qnrS 和 tetA ( A )基因的新引物組，滿足開發(fā)針對(duì)qPCR引物的嚴(yán)格要求，新引物對(duì)和qPCR方案的驗(yàn)證表明，這些引物具備好的靶標(biāo)特異性，較高的PCR效率以及寬的線性動(dòng)態(tài)范圍。在靈敏度方面，新引物具有較低的檢測限與定量限值，檢測過程中體現(xiàn)出良好的重現(xiàn)性，能夠確保檢測結(jié)果的可靠性與一致性，在極低靶標(biāo)DNA濃度的樣品中也有很好的穩(wěn)定性。

4 未來發(fā)展方向

4.1

技術(shù)創(chuàng)新

4.1.1 dPCR

dPCR是一種對(duì)靶核酸進(jìn)行絕對(duì)定量的新型方法。dPCR的定量原理基于分子在大量分區(qū)內(nèi)的隨機(jī)分布，這種分布遵循泊松分布規(guī)律。在dPCR檢測過程中，每個(gè)分區(qū)都可被視作一個(gè)獨(dú)立的PCR微反應(yīng)器。通過熒光檢測技術(shù)，能夠精準(zhǔn)識(shí)別包含擴(kuò)增靶序列的分區(qū)。依據(jù)泊松分布的特性，確定PCR陽性分區(qū)在總分區(qū)中的占比，精確測定靶序列的濃度，無需依賴傳統(tǒng)的校準(zhǔn)步驟。學(xué)者將dPCR作為第三代PCR工具，量化水生和陸地生態(tài)系統(tǒng)中的微生物。

與qPCR相比，dPCR精度更高、對(duì)低拷貝數(shù)檢測的靈敏度更高，不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線以及對(duì)抑制劑耐受性高。在定量檢測廢水中微生物時(shí)，許多研究對(duì)于檢測痕量水平存在的病原體建議使用dPCR，通過dPCR獲得定量限，效果顯著，表明其在廢水檢測中的潛在有用性。缺點(diǎn)是使用dPCR可能會(huì)延長處理時(shí)間和增加成本。dPCR因制備與處理流程耗時(shí)較長、分區(qū)不均，導(dǎo)致假陽性或假陰性風(fēng)險(xiǎn)升高，受限于儀器成本高昂及單個(gè)樣本需分割為高密度反應(yīng)單元，致使總體應(yīng)用成本高于常規(guī)qPCR技術(shù)。使用dPCR進(jìn)行常規(guī)微生物水質(zhì)檢測可能會(huì)受成本的限制，在現(xiàn)階段可能不切實(shí)際。

4.1.2 微滴式數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(droplet digital PCR,ddPCR)

ddPCR是dPCR的子類別，具有更高的檢測精度和高通量分析能力，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線或內(nèi)參基因的依賴度低，適用于低豐度目標(biāo)物檢測。ddPCR在PCR擴(kuò)增之前將DNA模板分成許多水油乳液液滴，最終的信號(hào)讀取在PCR到達(dá)擴(kuò)增終點(diǎn)時(shí)進(jìn)行。ddPCR可定量檢測水樣中人畜共患細(xì)菌病原體，如沙門氏菌屬、空腸彎曲菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌；檢測河流沉積物中低濃度的沙門氏菌。Falzone等使用ddPCR在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中模擬水熱處理過程快速檢測嗜肺軍團(tuán)菌，結(jié)果表明，ddPCR能夠準(zhǔn)確檢測低濃度的嗜肺軍團(tuán)菌，與RT-qPCR相比，具有更高的準(zhǔn)確性和靈敏度，可以快速檢測并避免可能的軍團(tuán)病暴發(fā)。ddPCR在靈敏度、精度和可重復(fù)性方面優(yōu)于傳統(tǒng)定量PCR，不容易受到PCR抑制劑的影響，并且無需標(biāo)準(zhǔn)曲線即可進(jìn)行絕對(duì)定量。一旦整個(gè)操作系統(tǒng)和化學(xué)試劑的成本大幅降低，樣品的處理能力或檢測通量和動(dòng)態(tài)范圍得到極大提升，這項(xiàng)技術(shù)就可以更廣泛地應(yīng)用于環(huán)境研究。

4.1.3 mqPCR

mqPCR在同一反應(yīng)體系中設(shè)計(jì)多組熒光標(biāo)記探針，單次反應(yīng)可同步檢測4～6種靶標(biāo)。 Zhang等結(jié)合3個(gè)qPCR引物探針組開發(fā)優(yōu)化三重qPCR檢測，該方法同時(shí)檢測廢水中空腸彎曲桿菌、大腸彎曲桿菌和拉氏彎曲菌。Li等將mqPCR技術(shù)與PMA相結(jié)合，在一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)檢測水樣中活的嗜肺軍團(tuán)菌、鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌，應(yīng)用月桂酰肌氨酸鈉增強(qiáng)PMA對(duì)死菌通透性，結(jié)果表明，具有相當(dāng)?shù)奶禺愋院挽`敏度并且縮短了檢測時(shí)間。

mqPCR通過在一次運(yùn)行中結(jié)合多個(gè)qPCR反應(yīng)，顯著提高檢測通量，節(jié)省檢測時(shí)間和減少成本。但采用此方法時(shí)需要注意引物相互作用的可能性高，對(duì)引物特異性和所有引物對(duì)的兼容性要求高。嚴(yán)格的檢測設(shè)計(jì)和充分的優(yōu)化對(duì)于mqPCR應(yīng)用于環(huán)境調(diào)查至關(guān)重要。

4.1.4 小結(jié)

dPCR與ddPCR通過絕對(duì)定量、高精度及抗抑制劑能力，突破了qPCR依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線的局限，但高成本與耗時(shí)處理限制其廣泛應(yīng)用；mqPCR通過多靶標(biāo)同步檢測顯著提升通量，但引物設(shè)計(jì)復(fù)雜度高,易引發(fā)交叉反應(yīng)。未來需結(jié)合技術(shù)優(yōu)勢(shì)，以ddPCR提升低豐度目標(biāo)檢測可靠性，mqPCR優(yōu)化高通量篩查效率，同時(shí)推動(dòng)設(shè)備微型化與成本降低，構(gòu)建多技術(shù)聯(lián)用體系，并制定標(biāo)準(zhǔn)化流程，以平衡精準(zhǔn)性、效率與經(jīng)濟(jì)性，滿足復(fù)雜水體的動(dòng)態(tài)監(jiān)測需求。表3比較了不同PCR的作用機(jī)制及優(yōu)缺點(diǎn)。

表3 不同PCR 方法作用機(jī)制及應(yīng)用特性比較

4.2

標(biāo)準(zhǔn)化與政策推動(dòng)

不同實(shí)驗(yàn)室在qPCR試驗(yàn)操作、引物探針設(shè)計(jì)、結(jié)果分析等環(huán)節(jié)存在差異，導(dǎo)致數(shù)據(jù)可比性差。國內(nèi)外相關(guān)組織正積極推動(dòng)標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程。國際標(biāo)準(zhǔn)化組織制定了《分子生物標(biāo)志物分析 農(nóng)業(yè)和食品生產(chǎn)中分子生物標(biāo)志物分析方法的詞匯表》(ISO 16577:2022)，規(guī)定了qPCR術(shù)語、試驗(yàn)流程、性能指標(biāo)等；《水質(zhì) 用定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)濃縮和基因擴(kuò)增法檢測和定量軍團(tuán)菌和/或嗜肺軍團(tuán)菌 第2部分:現(xiàn)場方法》(ISO/TS 12869—2:2024)中規(guī)定了使用qPCR對(duì)軍團(tuán)菌屬和嗜肺軍團(tuán)菌進(jìn)行現(xiàn)場檢測和定量的技術(shù)要求。我國也依據(jù)國情，出臺(tái)了針對(duì)水源性微生物檢測的國家標(biāo)準(zhǔn)，如《實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀性能評(píng)價(jià)通則》(GB/T 42753—2023)；《循環(huán)冷卻水中軍團(tuán)菌的檢測》(GB/T 40392—2021)規(guī)定了循環(huán)冷卻水中軍團(tuán)菌qPCR檢測方法，包括水樣采集、保存、運(yùn)輸，核酸提取，qPCR擴(kuò)增及結(jié)果判定等流程。這些標(biāo)準(zhǔn)化側(cè)重于使用qPCR檢測軍團(tuán)菌，缺少使用qPCR檢測其余水源性致病微生物的標(biāo)準(zhǔn)，需要相關(guān)組織和機(jī)構(gòu)加快制定針對(duì)其余水源性致病微生物的qPCR檢測標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步完善水體微生物檢測的標(biāo)準(zhǔn)體系，提升檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性和一致性。

5 結(jié)論

qPCR在檢測水源性致病微生物領(lǐng)域具有重要價(jià)值。它基于熒光信號(hào)與DNA擴(kuò)增動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)原理，通過精準(zhǔn)測定Ct值實(shí)現(xiàn)對(duì)初始模板的定量分析，依據(jù)熒光標(biāo)記物作用方式的差異，在水源性致病微生物檢測中發(fā)揮不同作用。在常見水源性致病微生物檢測方面，qPCR展現(xiàn)出顯著優(yōu)勢(shì)。針對(duì)細(xì)菌，能靶向特異性基因快速定量，克服傳統(tǒng)培養(yǎng)法的弊端；檢測病毒時(shí)，對(duì)雙鏈DNA病毒和單鏈RNA病毒都有高靈敏度和特異性，mqPCR技術(shù)的出現(xiàn)提升了檢測通量。對(duì)于原蟲，可檢測到極低濃度的原蟲DNA，HT-qPCR技術(shù)提高了檢測效率，縮短檢測時(shí)間。在不同水體環(huán)境中，qPCR檢測飲用水時(shí)實(shí)現(xiàn)高靈敏度，在廢水與污水處理廠以及娛樂用水的檢測中也發(fā)揮關(guān)鍵作用。對(duì)于區(qū)分活菌、死菌，應(yīng)對(duì)抑制劑干擾以及優(yōu)化引物設(shè)計(jì)等挑戰(zhàn)，研究人員積極探索優(yōu)化策略，PMA-qPCR技術(shù)有效解決了活菌與死菌區(qū)分的難題；通過內(nèi)部或外部擴(kuò)增對(duì)照、稀釋曲線評(píng)估抑制劑影響，并采取添加補(bǔ)充劑等措施提升檢測靈敏度；設(shè)計(jì)特異性引物則有效控制了假陽性問題。

dPCR、ddPCR以及mqPCR等新興技術(shù)展現(xiàn)出巨大潛力。dPCR精度高、對(duì)低拷貝數(shù)檢測靈敏且無需標(biāo)準(zhǔn)曲線；ddPCR檢測精度更高，適用于低豐度目標(biāo)物檢測；mqPCR提高了檢測通量，節(jié)省時(shí)間和成本。盡管這些新技術(shù)目前存在成本高、引物設(shè)計(jì)要求嚴(yán)格等局限，但隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，有望在水源性致病微生物檢測領(lǐng)域得到更廣泛應(yīng)用，為保障水體安全和公共衛(wèi)生提供更強(qiáng)大的技術(shù)支撐。

本文來源于《凈水技術(shù)》2025年第9期“凈水技術(shù)前沿與熱點(diǎn)綜述”欄目，內(nèi)容略有刪減，原標(biāo)題為《實(shí)時(shí)熒光定量PCR在水源性致病微生物檢測中的應(yīng)用》，作者張星宇,周婉婷,邢方瀟,張 嵐*(中國疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所,傳染病溯源預(yù)警與智能決策全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100050)。

來源：本文源自《凈水技術(shù)》2025年第9期“凈水技術(shù)前沿與熱點(diǎn)綜述”欄目。

排版：李佳佳

校對(duì)：李佳佳

審核：阮辰旼

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