情景重現(xiàn)

中醫(yī)藥科研項目正在快速發(fā)展，但因?yàn)橹兴幊煞謴?fù)雜，一般SCI發(fā)表都會要求對中藥進(jìn)行成分表征，或做中藥原液、或檢測入血成分，以確定可能發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。

那么，如何來制備中藥的含藥血清，血清中的成分又是用什么方法檢測呢？我們本次將前期的一些推文匯總，向大家匯報：

1.

1.1實(shí)驗(yàn)動物的選擇

采用正常動物或模型動物的血清均有，并且采用健康正常動物應(yīng)盡量與模型動物一致。因此，選擇健康動物還是模型動物需要進(jìn)一步探討。

1.2給藥方案的選擇

（1）給藥劑量：若將含藥血清看作一種藥物，那么給藥劑量取決于2 個方面：一是動物給藥量，二是培養(yǎng)體系或反應(yīng)體系中含藥血清濃度。動物給藥量換算公式為給藥劑量＝人臨床用量×動物等效劑量比值×培養(yǎng)液中血清稀釋度，如果是做入血成分分析，可以適當(dāng)提高給藥劑量（5-10倍臨床劑量換算）。

（2）給藥、采血時間：目前有幾種經(jīng)驗(yàn)給藥方案：1）7～10 d 給藥法（每天 1 次，連續(xù)給藥 7～10 d）；2）3 次給藥法（連續(xù) 3 次，第 1、2 次間隔 20 h，第 2、3 次間隔 4 h）；3）2 次給藥法（第 1 次給藥后 2 h，再以相同劑量重復(fù)給藥 1 次）等。采血時間一般在末次給藥后 0.5～3 h，一般不超過 6 h，采血時間過早，部分藥物組分未被吸收入血；采血時間過長，部分藥物組分在體內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)化或被排泄掉，理想的采血時間應(yīng)落在藥物達(dá)到穩(wěn)態(tài)血藥濃度期間。

1.3血清的處理

大部分研究人員對含藥血清采用 56 ℃水浴加熱 30 min的滅活方式，可以除去血清本身含有的補(bǔ)體等干擾實(shí)驗(yàn)的活性成分；也有研究人員將含藥血清經(jīng)乙醇、丙酮等有機(jī)試劑處理，通過使蛋白質(zhì)變性去除血清中的酶、激素等，從而保留藥物本身的作用。

具體可見往期公眾號推文：《

2.中藥含藥血清制備及成分鑒定流程：

制備流程見下圖：

看了流程圖，下面我們再來學(xué)習(xí)下入血成分-代謝組檢測相關(guān)的實(shí)驗(yàn)方法：

1.從血清樣品中提取代謝物

血清樣品在4°C下解凍后，將200μL血清與預(yù)冷卻的800μL甲醇混合，并將上清液在4°C下以20000 g離心10分鐘。上清液通過0.22μm濾膜過濾，獲得待測樣品。

2.UHPLC-MS/MS的色譜和質(zhì)譜條件

使用Thermo Scientific UltiMate 3000 HPLC和ACQUITY UPLC T3柱（100 mm×2.1 mm，1.8μm），自動進(jìn)樣器溫度為8°C，流速為0.3 mL/min，柱溫為50°C。用2μL的進(jìn)樣體積洗脫樣品。流動相由0.1%甲酸水溶液（A）和0.1%甲酸乙腈溶液（B）組成。梯度洗脫程序?yàn)?-0.8min，2%b；0.8-2.8分鐘，2%-70%B；2.8-5.6分鐘，70%-90%B；5.6–8分鐘，90%–100%；8-8.1分鐘，100%-2%b；8.1–10分鐘，2%b。Thermo Q Exactive Focus質(zhì)譜儀在以下條件下運(yùn)行：電噴霧離子（ESI）源、正負(fù)離子模式、正離子噴霧電壓4.00 kV、負(fù)離子噴霧電壓3.00 kV、鞘氣體35 Arb、輔助氣體10 Arb、毛細(xì)管溫度320°C、全掃描分辨率70000、掃描等離子體芯比范圍70–1050、HCD二次裂解、，碰撞電壓為30eV。

3.數(shù)據(jù)處理

使用MassHunter Profider軟件（版本B.06.00；美國加利福尼亞州圣克拉拉市，安捷倫）提取樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和比較。根據(jù)人類代謝組數(shù)據(jù)庫（HMDB）和METLIN的精確分子量確定了潛在的生物標(biāo)志物(http://metlin.scripps.edu/)數(shù)據(jù)庫。通過MetaboAnalyst 4.0進(jìn)行代謝途徑富集分析(http://www.metaboanalyst.ca/)網(wǎng)站。

本次推文再分享：文章Feiyiliu Mixture sensitizes EGFRDel19/T790M/C797S mutant non-small cell lung cancer to osimertinib by attenuating the PRC1/Wnt/EGFR pathway

3.含藥血清制備，如何判斷質(zhì)量可靠！

3.1.肉眼觀察一般情況：我們可以采用不同品系的動物制備血清/血漿，給完藥取血后，不溶血的情況下，應(yīng)該是如下：一般血清是略偏黃色，如果變紅那可能就是有點(diǎn)溶血，但是輕微溶血對于成分鑒定和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)是沒有影響的。

3.2.開展入血成分鑒定：如果肉眼觀察無異常后還是不放心，那就做液質(zhì)聯(lián)用成分鑒定，看看是否含有自己方子里面的成分。

4.中藥成分及入血成分如何檢測

中藥作為多組分復(fù)雜體系，具有成分繁多、結(jié)構(gòu)多樣、含量差異大、異構(gòu)體豐富等特點(diǎn)，定性分析面臨著很大的挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)色譜技術(shù)（薄層色譜、液相色譜等）的本質(zhì)是利用各成分在流動相和固定相中的分配能力差異而表現(xiàn)出的不同分離特性（薄層色譜為比移值Rf = 溶質(zhì)移動的距離/溶液移動的距離，氣相色譜和液相色譜為保留時間Rt）。當(dāng)色譜分離條件固定時，上述分離特性為固定值，因此可通過與對照品的Rf或Rt值進(jìn)行比較，判斷樣品是否含有某一化合物。此類方法具有設(shè)備價格相對較低、操作簡單、結(jié)果易讀等特點(diǎn)，因而廣泛用于中藥材及飲片、中成藥、中藥提取物等的質(zhì)量控制。然而，上述方法需要通過與對照品進(jìn)行比對才可對化合物進(jìn)行定性，因此，對未知成分的定性能力很差，無法滿足當(dāng)前全面闡明中藥化學(xué)組成的需求。

2020年，國家藥監(jiān)局發(fā)布《關(guān)于促進(jìn)中藥傳承創(chuàng)新發(fā)展的實(shí)施意見》，明確提出要“引入新工具、新方法、新技術(shù)”，深入挖掘中醫(yī)藥寶庫的科學(xué)內(nèi)涵。液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)不僅兼顧了色譜分離特性，還增加了質(zhì)譜維度信息（母離子質(zhì)荷比、子離子質(zhì)荷比、同位素分布）等，極大提高了鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確度，避免了常規(guī)色譜定性因保留時間相同導(dǎo)致的假陽性；此外，可通過母離子質(zhì)荷比、子離子質(zhì)荷比等信息對無對照品的化合物進(jìn)行定性，因而極大拓展了常規(guī)色譜技術(shù)對未知成分的定性能力，定性結(jié)果往往可達(dá)到100+。

這里我們分享一篇phytomedicine文章：Integrated serum pharmacochemistry and network pharmacology toexplore the mechanism of Yi-Shan-Hong formula in alleviating chronicliver injury（血清藥物化學(xué)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相結(jié)合探討Yi-Shan-Hong formula減輕慢性肝損傷的作用機(jī)制）

本文采用專業(yè)的液質(zhì)技術(shù)，將中藥成分和入血成分進(jìn)行鑒定，匯總表格包含了成分、荷質(zhì)比、碎片m/z、成分歸屬等。

與一般非靶的方式做中藥成分鑒定或入血成分不同，目前發(fā)2區(qū)以上文章，我們建議采用專業(yè)中藥自建數(shù)據(jù)庫，并進(jìn)行分析。

中藥成分分析是中藥物質(zhì)基礎(chǔ)的重要組成部分，目前以網(wǎng)藥、生信、組學(xué)為橋梁研究作用機(jī)制的高分思路，均需要中藥成分鑒定為基礎(chǔ)。

1).中藥藥效物質(zhì)篩選；

2).確定中藥質(zhì)量標(biāo)志物；

3).以入血成分或中藥成分鑒定為基礎(chǔ)的網(wǎng)絡(luò)藥理；

4).代謝組學(xué)分析篩選途徑靶點(diǎn)；

。。。。。。

5.如何確定中藥成分是否是有效成分

這里要告訴您一個事實(shí)，那就是做成分鑒定是不能確定有效成分。只能說明該中藥提取物里面含有這些成分。這些成分可以作為中藥發(fā)揮藥效的預(yù)測，就是可能是發(fā)揮作用。您可以通過網(wǎng)藥預(yù)測，或者進(jìn)一步做入血成分確定其中的可能的有效成分。

那如何確定中藥成分的有效性：

1.根據(jù)成分鑒定的結(jié)果，然后結(jié)合文獻(xiàn)，確定某個成分是否對研究的疾病有效；

2.做細(xì)胞或動物實(shí)驗(yàn)篩選有效物質(zhì)；

3.采用生信（網(wǎng)絡(luò)藥理）或組學(xué)（代謝組學(xué)）的方法，預(yù)測可能的有效成分或代謝物，找到有效標(biāo)志物。

還是把這張圖放上，或許對您有些啟發(fā)~

6.入血成分鑒定、含量測定、指紋圖譜與非靶代謝組的區(qū)分

入血成分鑒定：通過UPLC-MS/MS等方式比較中藥原液與動物給藥后的含藥血清中成分，確定哪些成分是入血前后都有的單體成分。

非靶代謝組：與入血成分鑒定的方法相似，通過UPLC-MS/MS等方式比較中藥原液與動物給藥后的血清、尿液、糞便、組織中的成分，并通過比對公共數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行富集分析，獲得通路途徑。

含量測定：相關(guān)公司叫做靶向代謝組檢測；這個主要就是采用液相或者液質(zhì)，對已知的成分購買標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并摸索流動相比例，將目標(biāo)成分分離度調(diào)整好，最終確定中藥液或者含藥血清等樣本里面的成分多少，是一個明確的含量值，有單位。

指紋圖譜：指某些復(fù)雜物質(zhì)，比如中藥，某種生物體或某種組織或細(xì)胞的DNA，蛋白質(zhì)經(jīng)適當(dāng)處理后，采用一定的分析手段（如液相、液質(zhì)等），得到的能夠標(biāo)示其化學(xué)特征的色譜圖或光譜圖。主要原則是系統(tǒng)性、特征性、穩(wěn)定性。有的研究會用到：中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)，以計算相似度等。

7.中藥成分及入血成分鑒定找誰做：

相關(guān)咨詢，加微信：1278317307。

中醫(yī)藥基礎(chǔ)科研服務(wù)：

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