最近發(fā)現(xiàn)的植物來源的外泌體樣納米囊泡（PNVs）是具有雙層膜結(jié)構(gòu)的納米級(jí)囊泡，在細(xì)胞間通訊、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和維持生物體穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用。PNVs富含生物活性分子，如核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，并表現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、再生和抗炎效果。來自不同來源的PNVs，包括葡萄、柚子、西蘭花、姜、甜橙、桑樹皮和茶，已在IBD的預(yù)防和治療中顯示出潛力。 金銀花是一種藥用和食用植物，以其清熱解毒和抗炎作用而聞名。它也是中國藥方桃花湯的主要成分，這是一個(gè)用于治療炎癥性腸?。↖BD）和潰瘍性結(jié)腸炎（UC）的著名草藥處方。現(xiàn)代藥理學(xué)研究已經(jīng)證實(shí)了其抗菌、抗病毒、抗炎、解熱和增強(qiáng)免疫的作用。然而，HNVs緩解IBD癥狀的具體機(jī)制尚不清楚。

2025年9月19日，浙江省人民醫(yī)院牟曉洲、北京化工大學(xué)劉惠玉、復(fù)旦大學(xué)鄒海在Adv Sci（IF 14.1）發(fā)表題為“Honeysuckle-Derived Nanovesicles Regulate Gut Microbiota for the Treatment of Inflammatory Bowel Disease”的文章。金銀花衍生的納米囊泡（HNVs）在多個(gè)層面（包括化學(xué)、物理和免疫屏障）對腸道屏障完整性發(fā)揮著保護(hù)作用，并顯示出顯著的治療效果。其作用機(jī)制包括：（a）調(diào)節(jié)腸道微生物群；（b）改變腸道微生物代謝產(chǎn)物；以及（c）通過微生物與宿主的相互作用保護(hù)腸道屏障，減少血液和結(jié)腸中的炎癥，并重新平衡調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞/Th17 反應(yīng)。這些結(jié)果表明，HNVs 通過多因素方式維持腸道黏膜修復(fù)和免疫穩(wěn)態(tài)。

摘要

炎癥性腸?。↖BD），包括潰瘍性結(jié)腸炎（UC）和克羅恩病，會(huì)嚴(yán)重?fù)p害患者的生活質(zhì)量，并且其特征表現(xiàn)為腸道屏障受損、致病細(xì)菌定植以及慢性炎癥。由于腸道微生物群在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、代謝途徑和屏障功能方面發(fā)揮著作用，因此它已成為治療炎癥性腸病的潛在靶點(diǎn)。在本研究中，研究了金銀花衍生的納米囊泡（HNVs）在由葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型中的治療潛力?？诜o予 HNVs 可減輕結(jié)腸炎癥狀，減少結(jié)腸炎癥和組織病理學(xué)損傷，恢復(fù)調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞/Th17 細(xì)胞的平衡，并修復(fù)腸道屏障完整性。這些效果與腸道微生物群的有利變化相關(guān)，包括有益細(xì)菌數(shù)量的增加、致病菌種類的減少，以及短鏈脂肪酸（SCFAs）水平的升高，這些對于維持黏膜免疫和屏障功能至關(guān)重要。此外，代謝組學(xué)分析表明，HNVs促進(jìn)了膽汁酸（BA）的吸收，并調(diào)節(jié)了膽汁酸的代謝，從而有助于維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)。綜合來看，這些發(fā)現(xiàn)表明HNVs通過調(diào)節(jié)短鏈脂肪酸水平和膽汁酸代謝發(fā)揮著保護(hù)作用，這為其作為治療炎癥性腸病的有前景的治療策略提供了支持。

1 HNVs的分離和鑒定

通過離心從勻漿中獲得金銀花汁（HJ），然后使用AKTA tangential flow filtration分離出HNVs（圖 1A）。HNVs的形態(tài)通過透射電子顯微鏡（TEM）和冷凍透射電子顯微鏡（cryo-TEM）進(jìn)行表征，結(jié)果表明，HNVs是均勻的橢圓形囊泡，直徑約為100納米（圖 1B）。HNVs的大小、直徑和zeta電位通過動(dòng)態(tài)光散射（DLS）進(jìn)一步分析。HNVs表現(xiàn)出負(fù)zeta電位，為?8.13 mV，平均大小為196納米（圖 1C,D）。) 此外，納米顆粒追蹤分析表明，大多數(shù)HNVs的直徑約為77 ± 19.6 nm，顆粒濃度為1.48 × 1012 particles/mL（圖 1E）。 在37°C下對模擬小腸液（圖1F）和模擬胃液（圖 1G）中的HNVs進(jìn)行穩(wěn)定性評(píng)估表明，HNVs在至少8小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定。通過使用二氯乙酸測量蛋白質(zhì)濃度來定量HNVs，測得新鮮HNVs的濃度為19.67 mg/mL，從2克干金銀花中獲得1毫升（圖 1H）。

圖1 金銀花外泌體樣囊泡（HNVs）的鑒定和表征。

2 HNVs在DSS誘導(dǎo)的IBD小鼠模型中的治療效果

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及相應(yīng)的流程圖如圖 2A 所示。與僅使用 DSS 的組相比，HNV 和 5-氨基水楊酸（5-ASA）治療組的體重減輕均有所減少（圖 2B），疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）評(píng)分更低（圖 2C），脾臟指數(shù)也有所降低（圖 2D），而肝臟指數(shù)無顯著差異（圖 2E）。此外，這些組的結(jié)腸長度增加（圖 2F、G），組織學(xué)結(jié)構(gòu)改善，炎癥細(xì)胞浸潤減少（圖 2H），從而導(dǎo)致組織學(xué)評(píng)分顯著降低（圖 2I）。

圖2 HNVs治療對DSS誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠實(shí)驗(yàn)性IBD癥狀的影響

3 HNVs 減輕 DSS 誘導(dǎo)小鼠的粘膜免疫浸潤和炎癥

在IBD患者中，粘膜中高水平的免疫細(xì)胞浸潤與炎癥活動(dòng)相關(guān)。因此，我們檢查了五組結(jié)腸組織中免疫浸潤的分布（圖3A）。DSS組在粘膜中顯示出顯著更多的CD3? T細(xì)胞、CD8? T細(xì)胞和髓過氧化物酶（MPO）陽性細(xì)胞，與HNVs或5-ASA治療組相比。此外，DSS組的M2巨噬細(xì)胞（M?）陽性細(xì)胞數(shù)量明顯少于DSS + HNVs-H組（圖3B–E）。此外，HNVs組和5-ASA治療組的促炎性細(xì)胞因子（包括MCP-1、TNF-α、IL-6和IFN-γ）顯著減少，同時(shí)抗炎性細(xì)胞因子IL-10增加，與DSS組相比（圖 3F–J）。

圖3 HNVs治療對DSS誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠實(shí)驗(yàn)性IBD中炎癥反應(yīng)的影響

4 HNVs 保護(hù) DSS 誘導(dǎo)小鼠的結(jié)腸粘膜屏障功能

在IBD患者中，緊密連接蛋白的表達(dá)和功能受損，導(dǎo)致腸道屏障功能下降。結(jié)果，有害物質(zhì)可以輕松穿透腸粘膜并引發(fā)炎癥反應(yīng)。因此，我們檢查了五組結(jié)腸組織中緊密連接蛋白的表達(dá)（圖 4A）。HNVs治療有助于保持結(jié)腸粘膜屏障的完整性，這表現(xiàn)在Occludin-和ZO-1陽性細(xì)胞的表達(dá)增加，結(jié)腸上皮內(nèi)粘蛋白-2 (Muc2)表達(dá)和粘液分泌杯狀細(xì)胞的數(shù)量增加，以及Ki67陽性增殖細(xì)胞面積的擴(kuò)大（圖 4B–F）。

圖4 HNVs治療對DSS誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠實(shí)驗(yàn)性IBD中結(jié)腸組織粘膜屏障的影響

5 高營養(yǎng)價(jià)值微生物在DSS誘導(dǎo)小鼠中的腸道微生物調(diào)節(jié)

使用Shannon、Simpson和Chao1指數(shù)分析α多樣性揭示，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間沒有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖 5A)。然而，主坐標(biāo)分析（基于加權(quán)UniFrac距離）和利用Bray-Curtis距離進(jìn)行的相似性分析表明，HNVs處理使腸道微生物群組成更接近正常對照組(Control)，并與DSS組形成不同的簇。這表明與DSS處理小鼠相比，HNVs顯著改變了微生物結(jié)構(gòu)(圖 5B,C)。接下來，我們評(píng)估了三個(gè)治療組中腸道微生物群的相對豐度。豐度最高的分類單元——即門水平的前10名和綱水平的前20名——顯示在圖 5D–G中。在門水平上，DSS處理的小鼠表現(xiàn)出減少的 Firmicutes 和增加的 Proteobacteria、Campylobacterota 和 Deferribacterota 水平。這些變化在 HNVs 治療后顯著逆轉(zhuǎn)（圖 5D,E）。

在屬水平上，DSS誘導(dǎo)的小鼠中HNVs處理組顯示顯著增加的Candidatus_Saccharimonas、Eubacterium、Turicibacter、Prevotellaceae_UCG-001和Clostridium_sensu_stricto_1的豐度，同時(shí)顯著減少Escherichia-Shigella、Akkermansia、Helicobacter和Bacteroides的豐度（圖 5F,G）。為了進(jìn)一步探索腸道微生物群組成以及DSS和DSS + HNVs-H組之間的關(guān)聯(lián)，進(jìn)行了生物標(biāo)志物選擇指標(biāo)分析、氣泡圖可視化、Circos圖表示和相關(guān)性分析。在DSS組中，大腸桿菌-志賀氏菌 被確定為主要的指標(biāo)細(xì)菌，而在HNVs處理組中，雙歧桿菌 被確定為優(yōu)勢指標(biāo)物種（圖 5H）。

此外，DSS組主要特征是存在大腸桿菌-志賀氏菌、阿克曼氏菌和擬桿菌，而HNVs處理組的優(yōu)勢類群是毛螺菌科_NK4A136群、候選菌_Saccharimonas、厚壁菌、雙歧桿菌、厭氧 negerin和普雷沃氏菌科_UCG-001（圖 5I,J）。 在DSS組和DSS + HNVs-H組的優(yōu)勢細(xì)菌之間觀察到顯著的負(fù)相關(guān)（圖5K）。這些發(fā)現(xiàn)表明，HNVs可能通過抑制大腸桿菌-志賀氏菌和阿克曼氏菌的過度增殖，同時(shí)促進(jìn)雙歧桿菌和擬桿菌等有益細(xì)菌的生長，對結(jié)腸炎具有治療效果。

圖5 HNVs治療對DSS誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠實(shí)驗(yàn)性IBD中腸道微生物群結(jié)構(gòu)的影響

6HNVs 對由 DSS 引發(fā)的結(jié)腸炎小鼠腸道代謝產(chǎn)物的生成有影響

值得注意的是，DSS + HNVs-H 組的盲腸內(nèi)容物中乙酸和丁酸的含量顯著高于 DSS 組（圖 6A-C）。此外，HNVs 治療顯著降低了 DSS 處理小鼠體內(nèi)對苯醌羧酸（DBH）的含量，同時(shí)增加了 23-去氧?；悄懰幔∟orDCA）的濃度（圖 6D-F）。這些發(fā)現(xiàn)表明，HNVs 顯著調(diào)節(jié)了與腸道微生物群相關(guān)的代謝物譜，主要是通過增強(qiáng)短鏈脂肪酸的生成。

圖6 hnv處理對dss誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性IBD C57BL/6小鼠盲腸內(nèi)容物中短鏈脂肪酸（SCFA）和膽汁酸（BA）濃度的影響

7 dss誘導(dǎo)小鼠hnv治療機(jī)制的轉(zhuǎn)錄組分析

為了闡明HNVs在IBD中的治療機(jī)制，對從小鼠收集的結(jié)腸組織進(jìn)行了RNA測序（RNA-seq）。主成分分析（PCA）顯示，基于基因表達(dá)譜，對照組、DSS組和DSS + HNVs-H組有明顯的分組（圖 7A）。差異表達(dá)基因（DEGs）的熱圖分析顯示，與DSS組相比，HNVs處理小鼠的基因顯著上調(diào)和下調(diào)。此外，顯著改變的DEGs的聚類分析顯示，各實(shí)驗(yàn)組的基因表達(dá)譜存在顯著差異（圖 7B）。條形圖分析顯示，與健康對照組相比，DSS組有208個(gè)基因上調(diào)和610個(gè)基因下調(diào)。相比之下，DSS + HNVs-H組有223個(gè)基因上調(diào)和1263個(gè)基因下調(diào)，表明炎癥過程的影響和隨后的治療效果（圖7C）。對差異表達(dá)基因（DEGs）的相關(guān)分析顯示，在對照組與DSS組和DSS組與DSS + HNVs-H組比較中，基于2倍變化，標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)（log2）> 1和q值 < 0.05，共有40個(gè)基因被共同調(diào)控（圖7D，E）。

KEGG中這些差異表達(dá)基因（DEGs）的通路富集分析確定了幾條顯著富集的代謝和信號(hào)通路，包括神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路、趨化因子信號(hào)通路和環(huán)腺苷酸（cAMP）信號(hào)通路（圖 7F）。為了進(jìn)一步探索涉及的分子機(jī)制，我們進(jìn)行了基因集合富集分析（GSEA）來評(píng)估DSS和DSS + HNVs-H組中激活的信號(hào)通路。如預(yù)期的那樣，DSS處理的小鼠顯示出顯著上調(diào)的趨化因子和cAMP信號(hào)通路。

趨化因子信號(hào)通路在免疫細(xì)胞募集和炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，而cAMP信號(hào)通路則參與多種生理過程，包括代謝、分泌、細(xì)胞增殖和分化（圖 7G）。這些發(fā)現(xiàn)表明，HNVs部分通過抑制趨化因子信號(hào)通路來發(fā)揮治療作用，從而減輕炎癥、恢復(fù)腸道屏障完整性，并調(diào)節(jié)腸道微生物群及其相關(guān)代謝物。

圖7 HNVs治療對DSS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性IBD C57BL/6小鼠結(jié)腸組織轉(zhuǎn)錄組的影響

8.hnv重新平衡dss誘導(dǎo)小鼠的CD25+Foxp3+Treg和IL17+CD4+T細(xì)胞反應(yīng)

為了證實(shí)這一點(diǎn)，研究人員對五組樣本中的結(jié)腸組織中 Foxp3 和 IL-17 蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測（圖 8A）。HNVs 治療導(dǎo)致結(jié)腸黏膜出現(xiàn)免疫抑制現(xiàn)象，表現(xiàn)為 Foxp3?細(xì)胞數(shù)量顯著增加，而 IL-17 陽性細(xì)胞的面積減少（圖 8B、C）。此外，RNA-seq 分析顯示，與 DSS 組相比，DSS + HNVs-H 組的結(jié)腸組織中炎癥相關(guān)通路（包括 IL-17 信號(hào)通路）的表達(dá)顯著下調(diào)（圖 8D）。同樣地，我們觀察到 HNVs 治療組的小鼠中炎癥性 IL-17 的表達(dá)下調(diào)，而抗炎性細(xì)胞因子 IL-10 的表達(dá)上調(diào)。此外，研究發(fā)現(xiàn)hnv處理通過誘導(dǎo)Foxp3 + Tregs、抑制IL-17 + CD4 + T細(xì)胞和IFN-γ + CD4 + T細(xì)胞抑制dss誘導(dǎo)的炎癥。這些發(fā)現(xiàn)表明，hnv可能通過重新平衡CD25 + Foxp3 + Treg和IL-17 + CD4 + T細(xì)胞反應(yīng)來促進(jìn)粘膜愈合（圖8E-J）。

圖8 hnv治療對dss誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠實(shí)驗(yàn)性IBD中Th17/Treg細(xì)胞平衡的影響

9.在腸道菌群枯竭的dss誘導(dǎo)小鼠中，hnv不能緩解結(jié)腸炎癥狀

為了評(píng)估HNVs的治療效果是否通過改變腸道微生物群和相關(guān)代謝物來介導(dǎo)，我們在野生型（WT）C57BL/6小鼠中建立了糞便微生物移植（FMT）模型（圖 9A）。使用一種廣譜抗生素雞尾酒（新霉素（Neo）、萬古霉素（Van）、甲硝唑（Metro）和青霉素（Amp；Abx））來耗盡宿主的原生腸道微生物群。在微生物群耗盡的DSS誘導(dǎo)的小鼠中，HNVs治療與DSS組相比，沒有顯著改善體重、DAI評(píng)分或結(jié)腸長度（圖 9B–E）。

此外，HNVs 的治療未能恢復(fù)腸道屏障的完整性，這一點(diǎn)從嚴(yán)重的隱窩破壞、組織結(jié)構(gòu)紊亂、廣泛的免疫細(xì)胞浸潤以及炎癥性結(jié)腸中的顯著上皮損傷中得到了證實(shí)（圖 9F）。這些發(fā)現(xiàn)表明，糞便微生物群的存在對于 HNVs 發(fā)揮其治療作用是必不可少的。

然后，從不同處理的小鼠中制備fmt。具體來說，通過灌胃給予健康小鼠、hnvs處理小鼠和dss誘導(dǎo)小鼠的糞便細(xì)菌懸浮液，以重建微生物群缺失（abx處理）小鼠的腸道微生物群（圖9G）。正如預(yù)期的那樣，與DSS組相比，fmt - hnv組的體重減輕、DAI評(píng)分、結(jié)腸縮短、脾臟指數(shù)和組織病理學(xué)病變均顯著改善（圖9H-L）。

圖9 HNVs治療對DSS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性IBD癥狀在腸道微生物群耗盡的C57BL/6小鼠的影響

結(jié)論

這項(xiàng)研究表明，HNVs在治療IBD方面具有顯著的潛力，是一個(gè)有前景的口服治療選擇。HNVs作為小鼠DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的優(yōu)秀保護(hù)劑，通過幾種關(guān)鍵機(jī)制發(fā)揮作用：a) 調(diào)節(jié)腸道微生物群，b) 改變腸道微生物代謝物，c) 改善失衡的Treg/Th17反應(yīng)，d) 保護(hù)腸道屏障，并通過微生物-宿主相互作用減少結(jié)腸和全身循環(huán)中的炎癥。由于其天然來源、顯著的治療效果和出色的生物相容性，HNVs成為在IBD管理中臨床應(yīng)用的非常有前途的候選者。

https://advanced.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202505208

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