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導(dǎo)讀

據(jù)報(bào)道山藥多糖（SYDT）可保護(hù)糖尿病腎病小鼠的腎功能并減輕其腎臟纖維化。本研究的目的是基于多組學(xué)分析，利用體內(nèi)模型確定SYDT對(duì)順鉑(CDDP)誘導(dǎo)的慢性腎間質(zhì)纖維化(RIF)的影響及其潛在的分子機(jī)制。

給大鼠腹腔注射單劑量CDDP，然后用SYDT或氨磷汀（AMF）治療。檢測(cè)尿液中N-acetyl-β-d-glucosaminidase (NAG)、血尿素氮(BUN)和血清肌酐(Scr)的水平，以評(píng)估腎功能。分別使用蘇木精和伊紅（H&E）以及Masson三色染色法評(píng)估腎組織損傷和纖維化。此外本研究還應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)預(yù)測(cè)了SYDT的可能作用機(jī)制，并通過(guò)多項(xiàng)相關(guān)檢查進(jìn)行了驗(yàn)證。

SYDT可顯著改善CDDP大鼠的腎功能，減輕腎組織損傷和纖維化，降低vimentin、α-SMA和CTGF的蛋白水平，而SYDT能明顯提高CDDP大鼠腎組織中MMP-1的蛋白水平。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析，CDDP模型組和SYDT-M組之間有1130個(gè)不同表達(dá)基因（DEGs），這表明代謝通路可能是主要的相關(guān)靶點(diǎn)。與轉(zhuǎn)錄組分析一致，代謝組分析在SYDT-M組和CDDP模型組之間發(fā)現(xiàn)了276種差異表達(dá)代謝物（DEMs），主要集中在甘油磷脂代謝中。轉(zhuǎn)錄組和代謝組的綜合分析表明，SYDT通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因Gpd2、Gpam、Agpat3、Lcat和Pla2g4b，抑制了甘油磷脂代謝途徑。分析表明，PLD信號(hào)通路可能是最相關(guān)的靶點(diǎn)。此外相關(guān)的信號(hào)通路分析證實(shí)，SYDT通過(guò)下調(diào)PLD通路抑制了CDDP誘導(dǎo)的大鼠RIF。

研究表明SYDT可以通過(guò)抑制甘油磷脂代謝和PLD信號(hào)通路來(lái)緩解CDDP

誘導(dǎo)的體 內(nèi) RIF 。

論文ID

原名：Multi-omics analysis reveals the protective effects of

Chinese yam

譯名：多組學(xué)分析揭示山藥多糖對(duì)順鉑誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化的保護(hù)作用

期刊：Phytomedicine

IF：8.3

發(fā)表時(shí)間：2024.11

通訊作者：楊玉芳

通訊作者單位：廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.SYDT可減輕CDDP誘導(dǎo)的RIF大鼠的腎功能、腎損傷和腎纖維化

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和藥物處理如表1所示。與正常組相比，CDDP模型組的BUN、Scr和尿液NAG水平顯著升高。與CDDP模型組相比，SYDT治療組和AMF組的BUN、Scr和尿液NAG水平顯著下降，此外SYDT-M組的BUN和Scr水平顯著低于SYDT-L組，SYDT-H組的尿NAG水平顯著低于SYDT-M組（圖1A-C）。

H&E染色結(jié)果顯示正常組的腎組織無(wú)組織病理學(xué)損傷。與正常組相比，CDDP模型組腎小管萎縮（黑色箭頭），部分腎小管上皮細(xì)胞變性、水腫或壞死（空心箭頭），腎間質(zhì)內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（黑色三角形）（圖1D）。此外CDDP模型組的腎小管損傷評(píng)分顯著高于正常組，而SYDT處理組和AMF組的腎小管損傷評(píng)分則顯著低于CDDP模型組（圖1E）。此外SYDT-H組的腎小管損傷評(píng)分顯著低于SYDT-M組（圖1E）。

Masson三色染色分析表明，正常組腎臟組織中沒(méi)有纖維化，而CDDP治療導(dǎo)致了明顯的RIF（圖1F）。與正常組相比，CDDP模型組的RIF相對(duì)面積顯著增加。相反與CDDP模型組相比，SYDT處理組和AMF組的RIF相對(duì)面積顯著縮小。值得注意的是，隨著SYDT劑量的增加，RIF的相對(duì)面積顯著縮?。▓D1G）。

圖1 SYDT對(duì)CDDP誘導(dǎo)的RIF大鼠腎功能、病理性腎損傷和腎纖維化的影響。（A-C）大鼠BUN、Scr和尿NAG水平。（D）H&E染色腎組織樣本的代表性圖像，放大倍率× 400（黑色箭頭：腎小管擴(kuò)張和萎縮?？招募^：腎小管上皮細(xì)胞水腫、變性或壞死。黑色三角形：炎性細(xì)胞浸潤(rùn)）。（E）各組大鼠腎組織的腎小管間質(zhì)損傷評(píng)分。（F）Masson三色染色腎組織樣本的代表性圖像。放大倍率×400。（G）各組大鼠腎組織纖維化的相對(duì)面積（%）。與正常組相比，*P<0.05；與CDDP模型組相比，#P<0.05；與SYDT-M組相比，&P<0.05（n=8-10）。

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和藥物處理

2. SYDT對(duì)CDDP誘導(dǎo)的RIF大鼠腎臟組織中波形蛋白（vimentin）、α-SMA、CTGF和MMP-1水平的影響

WB分析表明，與正常組相比，CDDP模型組的波形蛋白、α-SMA和CTGF水平顯著升高，而MMP-1水平則顯著下降。相比之下，SYDT治療組和AMF組的波形蛋白、α-SMA和CTGF蛋白水平相對(duì)于正常組顯著下降，而MMP-1的表達(dá)則有所增加（圖2）。此外與SYDT-L組相比，SYDT-M組的波形蛋白、α-SMA和CTGF蛋白水平顯著下降（圖2B-D）。與SYDT-M組相比，SYDT-H組的波形蛋白和CTGF蛋白水平顯著下降（圖2C-D）。

圖2 SYDT對(duì)大鼠腎組織中α-SMA、波形蛋白、CTGF和MMP-1蛋白表達(dá)水平的影響。(A）大鼠腎組織中α-SMA、波形蛋白、CTGF和MMP-1表達(dá)的WB分析。(B-E)腎組織中α-SMA、波形蛋白、CTGF和 MMP-1蛋白水平的定量分析。與正常組相比，*P<0.05；與CDDP模型組相比，#P<0.05；與SYDT-M組相比，&P<0.05（n=3-4）。

3. SYDT對(duì)CDDP誘導(dǎo)的RIF大鼠腎組織轉(zhuǎn)錄組的影響

主成分分析（PCA）顯示，正常組、CDDP模型組和SYDT-M組的基因表達(dá)存在顯著差異（圖3A）。熱圖顯示，CDDP模型組的趨勢(shì)與正常組相反。然而SYDT治療逆轉(zhuǎn)了這一異常趨勢(shì)，表明SYDT恢復(fù)了CDDP誘導(dǎo)的異常轉(zhuǎn)錄組圖譜（圖3B）?；鹕綀D顯示，CDDP模型組和SYDT-M組之間存在1130個(gè)DEGs，其中558個(gè)基因下調(diào)，572個(gè)基因上調(diào)（圖3C）。這些DEGs可能涉及分子功能（MF）、細(xì)胞成分（CC）和生物過(guò)程（BP）（圖3D）。此外KEGG通路分析顯示了40多個(gè)信號(hào)通路，表明這些DEGs主要富集在代謝通路中（圖3E）。

圖3 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析預(yù)測(cè)了SYDT的潛在靶標(biāo)。(A)正常組、CDDP組和SYDT組的PCA評(píng)分圖。(B) 正常組、CDDP和SYDT的熱圖。(C) CDDP與SYDT的基因火山圖。(D) 基因本體（GO）富集分析。(E) CDDP組 vs SYDT-M組的KEGG通路分析。(Nomal：正常組；CDDP：CDDP模型組；SYDT：SYDT-M組)。

4. SYDT對(duì)CDDP誘導(dǎo)的RIF大鼠腎組織代謝的影響

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析預(yù)測(cè)，SYDT抗腎臟纖維化的潛在機(jī)制可能涉及代謝途徑。因此采用非靶向代謝組學(xué)方法評(píng)估了SYDT對(duì)代謝組的影響。PCA圖顯示，質(zhì)量控制（QC）樣本之間存在一定程度的分散，但R2X=0.486>0.4表明主成分差異不大（圖4A）。此外從基峰強(qiáng)度（BPI）色譜圖來(lái)看，峰形差別不大，表明質(zhì)控樣品的代謝輪廓基本相同（圖4B）。這些數(shù)據(jù)表明，超高效液相色譜-質(zhì)譜（UPLC-MS）的重復(fù)性和穩(wěn)定性較高，可用于后續(xù)檢測(cè)。

如圖4C所示，與正常組相比，服用CDDP后會(huì)導(dǎo)致BPI色譜異常改變，尤其是在4-5分鐘、5-6分鐘和10-11分鐘范圍內(nèi)。然而SYDT治療逆轉(zhuǎn)了這些異常改變，表明SYDT能夠在一定程度上改善CDDP誘導(dǎo)的異常代謝組譜。

正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）顯示CDDP模型組和SYDT-M組之間存在顯著差異（圖4D），OPLS-DA循環(huán)檢驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)（圖4E）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)CDDP模型組和SYDT-M組之間有276種DEMs（圖4F）。值得注意的是，CDDP模型組與SYDT-M組之間的DEMs主要富集于甘油磷脂代謝和葉酸的一個(gè)碳池（P<0.05，impact> 0.1）（圖4G）。在這些途徑中，甘油磷脂代謝途徑的相關(guān)性最高（圖4G）。

圖4 SYDT能調(diào)節(jié)CDDP引起的代謝紊亂。(A）質(zhì)控樣本的PCA評(píng)分圖；（B）質(zhì)控樣本的BPI圖；（C）BPI色譜圖；（D）CDDP vs SYDT的OPLS-DA圖；（E）CDDP vs SYDT的OPLS-DA檢驗(yàn)圖；（F）CDDP vs SYDT的代謝物火山圖；（G）富集的代謝通路。(Nomal：正常組。CDDP：CDDP 模型組。SYDT：SYDT-M 組）。

5.代謝途徑分析的結(jié)果

代謝途徑分析表明，CDDP模型和SYDT-M組之間的DEMs（代謝物）主要參與甘油磷脂代謝（表2）。

表2 代謝途徑分析的結(jié)果

6.轉(zhuǎn)錄組和代謝組的綜合分析

為了深入研究轉(zhuǎn)錄組和代謝組之間的相關(guān)性，我們使用R軟件包和Spearman方法計(jì)算了相關(guān)系數(shù)。相關(guān)系數(shù)數(shù)據(jù)（|r|>0.80）被分成1-9個(gè)象限：第1和第9象限表明基因與代謝物負(fù)相關(guān)；第3和第7象限顯示正相關(guān)，第5象限表示不顯著，其余象限為部分相關(guān)。九象限圖顯示多個(gè)基因與代謝物之間存在負(fù)相關(guān)或正相關(guān)，表明代謝可能受到轉(zhuǎn)錄組的影響（圖5A-B）。

代謝組學(xué)分析表明，SYDT會(huì)影響甘油磷脂代謝途徑。為了闡明SYDT如何調(diào)節(jié)這一途徑，研究人員對(duì)轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)進(jìn)行了整合分析。綜合分析預(yù)測(cè)，SYDT可調(diào)控靶基因Gpd2、Gpam、Agpat3、Lcat 和 Pla2g4b的表達(dá)，從而影響磷脂酰乙醇胺（C00350: PE (22:5/22:6)）的合成，最終調(diào)控甘油磷脂代謝途徑（圖5C）。此外定量分析表明，SYDT在一定程度上顯著提高了Gpd2、Gpam和Agpat3的水平，降低了Lcat和Pla2g4b的水平。SYDT能顯著降低PE（22:5/22:6）的含量（圖5D-I），這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)了上述預(yù)測(cè)。

圖5 轉(zhuǎn)錄組和代謝組的綜合分析。(A-B)九象限圖顯示了基因和代謝物的相關(guān)性。x軸和y軸代表基因和代謝物的log2比值。黑點(diǎn)線代表不同的閾值。(C）甘油磷脂代謝途徑。(D-I）Gpd2、Gpam、Agpat3、Pla2g4b、Lcat的表達(dá)水平和PE（22:5/22:6）的含量。與正常組相比，*P<0.05；與CDDP相比，#P<0.05。(Normal：正常組；CDDP：CDDP模型組；SYDT：SYDT-M組）。

7. SYDT可抑制磷脂酶D(PLD)信號(hào)通路

轉(zhuǎn)錄組和代謝組的綜合分析表明，SYDT顯著改變了靶基因Agpat3和Pla2g4b的表達(dá)。有趣的是，Agpat3和Pla2g4b共同富集于PLD信號(hào)通路。因此驗(yàn)證了抑制PLD信號(hào)通路是否是SYDT緩解RIF的關(guān)鍵。WB分析顯示相對(duì)于正常組，CDDP模型組的PKCβ、PLD2和PLD4蛋白水平顯著升高。相比之下，與CDDP模型組相比，SYDT處理組和AMF組的PKCβ、PLD2 和 PLD4水平顯著降低（圖6A-D）。此外與SYDT-L組相比，SYDT-M組的PKCβ蛋白水平顯著降低，此外與SYDT-M組相比，SYDT-H組的PKCβ和PLD4水平顯著降低（圖6B-D）。

ELISA顯示，CDDP模型組的PA含量明顯高于正常組。相反與CDDP模型組相比，SYDT處理組和AMF組的PA含量顯著降低，此外與SYDT-M組相比，SYDT-H組PA含量顯著降低（圖6E）。

圖6 SYDT抑制了PLD信號(hào)通路。（A）大鼠腎組織中PKCβ、PLD2和PLD4表達(dá)的WB分析。（B-D）腎組織中PKCβ、PLD2和PLD4蛋白水平的定量分析。（E）用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)大鼠腎組織中的PA水平。與正常組相比，*P<0.05；與CDDP相比，#P<0.05；與SYDT-M組相比，&P<0.05。

CDDP是臨床常用的化療藥物，但常用劑量的CDDP很容易導(dǎo)致AKI。如果不及時(shí)治療，AKI可能會(huì)發(fā)展成RIF。在本研究中，大鼠暴露于CDDP后，尿NAG、Scr、BUN水平以及RIF、腎小管損傷評(píng)分、腎組織中的波形蛋白、α-SMA和 CTGF蛋白水平均顯著升高，而MMP-1蛋白水平則顯著降低（P<0.05）（圖1-2）。這些結(jié)果表明單劑量CDDP可誘導(dǎo)大鼠RIF。然而CDDP誘導(dǎo)RIF的機(jī)制尚不清楚，也缺乏有效的治療措施。

一些研究表明，部分中藥可以減少RIF的發(fā)生。山藥是中國(guó)豐富的資源，而SYDT是山藥中最重要的生物活性成分。由于其成分和結(jié)構(gòu)復(fù)雜，SYDT具有多種功能，包括免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化、抗腫瘤。最近的一項(xiàng)研究報(bào)告稱，SYDT能保護(hù)糖尿病腎病小鼠的腎功能并減少腎纖維化，但具體機(jī)制尚未研究清楚。在我們的研究中，SYDT治療顯著降低了CDDP 誘導(dǎo)的大鼠尿NAG、Scr和BUN水平的升高（P<0.05）（圖1A-C）。SYDT還能顯著降低CDDP誘導(dǎo)的大鼠腎組織的RIF程度以及高水平的波形蛋白、α-SMA和CTGF，而MMP-1水平則顯著升高（P<0.05）（圖1-2）。這些結(jié)果表明SYDT可保護(hù)大鼠的腎功能并改善CDDP誘導(dǎo)的RIF。

隨后，我們利用轉(zhuǎn)錄組分析詳細(xì)研究了SYDT抵抗RIF的潛在機(jī)制。在這項(xiàng)研究中，RNA-seq發(fā)現(xiàn)CDDP模型組和SYDT-M組之間存在1130個(gè)DEGs，這些DEGs在多個(gè)通路中富集（圖3）。KEGG通路分析表明代謝通路是最相關(guān)的靶點(diǎn)（圖3）。

因此我們研究了SYDT對(duì)腎損傷和腎纖維化的保護(hù)作用是否與轉(zhuǎn)錄組分析顯示的代謝有關(guān)。在SYDT-M和CDDP模型組之間發(fā)現(xiàn)了276個(gè)DEMs，這些 DEMs主要富集在甘油磷脂代謝途徑中（圖4）。

甘油磷脂被認(rèn)為是生理活性化合物的來(lái)源，也是細(xì)胞膜的重要組成部分。它們不僅是信號(hào)分子，還是細(xì)胞膜內(nèi)蛋白質(zhì)的錨定物。甘油磷脂代謝紊亂會(huì)破壞細(xì)胞膜的生理結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞物質(zhì)交換和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能受損。當(dāng)細(xì)胞中甘油磷脂過(guò)多時(shí)，可能會(huì)引起脂質(zhì)中毒，最終破壞腎臟細(xì)胞。

在本研究中，轉(zhuǎn)錄組和代謝組的綜合分析表明，SYDT可調(diào)控靶基因（Gpd2、Gpam、Agpat3、Lcat和Pla2g4b）的表達(dá)，從而減少靶代謝產(chǎn)物（磷脂酰乙醇胺）的合成，抑制甘油磷脂途徑（圖5）。這些數(shù)據(jù)表明SYDT可恢復(fù)甘油磷脂代謝，有助于減輕腎細(xì)胞損傷和腎纖維化。

值得注意的是Agpat3和Pla2g4b（DEG之一）共同富集于PLD信號(hào)通路。因此PLD信號(hào)通路可能參與了SYDT對(duì)纖維形成的調(diào)控。PKCβ是一種經(jīng)典的蛋白激酶C，UUO小鼠的腎纖維化與PKCβ 的激活有關(guān)。當(dāng)受到刺激時(shí)PKCβ被激活并轉(zhuǎn)運(yùn)到膜上，在膜上通過(guò)非磷酸化的蛋白-蛋白相互作用激活PLD，從而參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)。PLD2和 PLD4屬于 PLD 家族，該家族由PLD1-PLD6六個(gè)成員組成。根據(jù)之前的報(bào)道，PLD2參與了小鼠肺纖維化的進(jìn)展，PLD2在CKD大鼠模型中表達(dá)增加。在兩種不同的腎臟纖維化模型中，PLD2和PLD4 的mRNA水平顯著增加，PLD4基因敲除導(dǎo)致抗纖維化細(xì)胞因子增加。PLD可催化底物磷脂酰膽堿（PC）產(chǎn)生PA。作為脂質(zhì)的次級(jí)信使，PA可調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路和細(xì)胞功能。PA是一種沒(méi)有頭部基團(tuán)的極性脂質(zhì)，其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)可影響細(xì)胞膜的特性。PA的積累會(huì)破壞細(xì)胞膜的完整性，并最終損害腎細(xì)胞。這些報(bào)告表明，PKCβ、PLD2、PLD4和PA與RIF有關(guān)。

SYDT治療顯著降低了這些蛋白的表達(dá)（P<0.05）（圖6）。這些結(jié)果表明SYDT通過(guò)下調(diào)PLD通路抑制了CDDP誘導(dǎo)的大鼠RIF，而PLD通路對(duì)于減少細(xì)胞外基質(zhì)的積累和纖維化的發(fā)展至關(guān)重要。

由于CDDP在腎小管中蓄積，并通過(guò)主動(dòng)或被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入腎小管上皮細(xì)胞，因此 CDDP誘導(dǎo)的腎損傷以腎小管上皮細(xì)胞損傷為主。在本研究中，CDDP暴露明顯激活了大鼠腎組織中的PLD通路，導(dǎo)致PKCβ、PLD2和PLD4水平升高，造成PA蓄積和腎小管上皮細(xì)胞損傷，導(dǎo)致腎小管間質(zhì)炎癥損傷和纖維化，大鼠腎功能持續(xù)下降。此外SYDT治療可抑制PLD通路，上述表現(xiàn)得到改善。因此SYDT可能是一種通過(guò)抑制PLD通路治療CDDP誘導(dǎo)的RIF的潛在藥物。

本研究對(duì)未來(lái)的臨床實(shí)踐有幾方面的意義。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)分析獲得的PLD通路的相關(guān)分子可能是藥物干預(yù)的潛在靶點(diǎn)，未來(lái)有可能針對(duì)這些靶點(diǎn)進(jìn)行藥物開(kāi)發(fā)。此外本研究的結(jié)果還為SYDT的實(shí)際應(yīng)用提供了理論依據(jù)，表明SYDT可能是一種針對(duì)CDDP誘導(dǎo)的RIF的潛在藥物。這意味著SYDT未來(lái)可作為一種輔助治療藥物，有望緩解CDDP化療患者的RIF，提高患者的生存質(zhì)量。

總之本研究首次報(bào)道了SYDT可通過(guò)調(diào)節(jié)PLD信號(hào)通路來(lái)改善CDDP誘導(dǎo)的大鼠RIF。這些發(fā)現(xiàn)可能為緩解CDDP誘導(dǎo)的RIF提供了一種策略。

本文提出了創(chuàng)新之處：首先，這是第一項(xiàng)綜合使用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)方法揭示SYDT對(duì)CDDP誘導(dǎo)的RIF的保護(hù)機(jī)制的研究。其次SYDT通過(guò)下調(diào)PLD信號(hào)通路有效改善了CDDP誘導(dǎo)的RIF。

圖7 SYDT抗CDDP誘導(dǎo)的RIF的機(jī)制。SYDT通過(guò)抑制PLD信號(hào)通路和甘油磷脂代謝通路緩解腎細(xì)胞和腎纖維化。

此外本研究有一定的局限性。首先它只是基于體內(nèi)研究。要全面闡明SYDT抗CDDP引起的RIF的潛在機(jī)制，還需要進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)。其次，由于客觀條件的限制，本研究無(wú)法確定SDTY對(duì)CDDP引起的腎損傷患者的影響。

結(jié)論

本研究首次表明，SYDT能有效保護(hù)CDDP誘導(dǎo)的RIF大鼠的腎功能，減輕腎組織損傷和纖維化。還利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)，首次報(bào)道了CDDP通過(guò)抑制甘油磷脂代謝途徑誘導(dǎo)體內(nèi)RIF。SYDT對(duì)PLD信號(hào)通路的調(diào)控也是一種新的可能機(jī)制（圖7）。這些策略可能會(huì)改善CDDP誘導(dǎo)的RIF，并有助于SYDT在RIF中的應(yīng)用。

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0944711324008572?via%3Dihub

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