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摘要

機(jī)械力在調(diào)節(jié)癌癥細(xì)胞行為中起著關(guān)鍵作用，尤其是在轉(zhuǎn)移過程中。在這里，我們提出了一種三維水凝膠平臺(tái)，該平臺(tái)嵌入了近炎癥響應(yīng)性大分子致動(dòng)器，能夠精確機(jī)械刺激癌癥細(xì)胞中的特定整合素亞型。通過利用該系統(tǒng)，我們研究了不同的力參數(shù)——大小、頻率和持續(xù)時(shí)間——如何影響卵巢癌癥細(xì)胞球體的遷移和侵襲，重點(diǎn)研究了整合素αvβ3和αvβ6。我們發(fā)現(xiàn)，機(jī)械刺激在早期會(huì)增強(qiáng)集體侵襲，并在后期遷移過程中引發(fā)間充質(zhì)到變形蟲的轉(zhuǎn)變，特別是當(dāng)高頻、大振幅的力破壞αvβ3配體相互作用時(shí)。相比之下，在類似條件下，通過更高的親和力結(jié)合與αvβ6結(jié)合的細(xì)胞顯示出有限的轉(zhuǎn)變。分子模擬通過揭示整合素特異性反應(yīng)的潛在機(jī)制來支持這些發(fā)現(xiàn)。該3D水凝膠平臺(tái)為研究癌癥細(xì)胞的機(jī)械傳導(dǎo)提供了強(qiáng)大的工具，并為開發(fā)靶向癌癥療法提供了潛在的見解。

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圖1：水凝膠平臺(tái)的設(shè)計(jì)和操作機(jī)制。

使用由分子致動(dòng)器CD-PNIPAM配體功能化的3D DexMA水凝膠平臺(tái)進(jìn)行細(xì)胞遷移操縱的示意圖，由NIR光調(diào)節(jié)。細(xì)胞球體被包裹在水凝膠中。當(dāng)用兩種不同的亞型特異性擬肽配體進(jìn)行功能化時(shí)——RGD用于αvβ3，RTDLDSLRT（簡稱RTD）用于αvα6——在不同的施力參數(shù)下4天后觀察到不同的細(xì)胞遷移模式。

圖2：用大分子致動(dòng)器官能化的DexMA水凝膠的制備、機(jī)械和光熱性能。

DexMA水凝膠的制備和細(xì)胞包封過程的示意圖。b DexMA水凝膠的時(shí)變儲(chǔ)能模量（G′）和損耗模量（G〃）。c不同濃度交聯(lián)劑（NCD肽）對(duì)DexMA水凝膠儲(chǔ)能模量（G′）的影響。該研究包括每組三個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)（n?=?3). d由DexMA和不同分子量的接枝CD-PNIPAM-RGD組成的水凝膠的溶脹行為。該研究包括每組三個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)（n?=?3). e用CD-PNIPAM-RGD、CD-PDMA-RGD和PNIPAM-RGD官能化的DexMA水凝膠的紫外-可見-近紅外吸收光譜。f在808℃下用CD-PNIPAM-RGD、CD-PDMA-RGD和PNIPAM-RGD官能化的DexMA水凝膠光熱加熱期間獲得的代表性熱圖像?nm激光照射（6.6μW/μm2），比例尺=1?cm.g在808℃下用CD-PNIPAM-TTC官能化的DexMA水凝膠區(qū)域的溫度波動(dòng)?nm激光曝光（6.6μW/μm2，1?Hz，10%占空比；地面溫度=29?°C），由紅外攝像頭拍攝。（b，c）中的數(shù)據(jù)以平均值表示??±??S.D.

圖3:DexMA 3D水凝膠中力刺激對(duì)細(xì)胞遷移的影響。

a-c移植CD-PNIPAM-RGD的DexMA 3D水凝膠中細(xì)胞的代表性亮場和熒光圖像。（a）、CD-PDMA-RGD（b）、PNIPAM-RGD（c），每種分子量為15?9.2以下的kDa?μW/μm2，10?Hz NIR照明在NIR照明期間隨時(shí)間跟蹤細(xì)胞。被照亮的區(qū)域由一個(gè)紅色虛線圓圈劃分。比例尺=50?μm.孵化溫度=25?°C.肌動(dòng)蛋白和細(xì)胞核分別顯示為綠色和藍(lán)色。d描繪在兩個(gè)確定的感興趣區(qū)域內(nèi)，包封在與CD-PNIPAM-RGD共軛的水凝膠中的球體芽長隨時(shí)間平均相對(duì)增加的圖：ROI1（NIR照射）和ROI2（非照射）。 n?=?55,47個(gè)細(xì)胞。 ***P??<??0.001 e–f分別用CD-PDMA-RGD（e）和PNIPAM-RGD（f）官能化的對(duì)照水凝膠進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)。ROI1（近紅外照明）和ROI2（非照明）。 n?=?55,從左到右分別為64、57、56個(gè)單元格。 ns p?=?0.32835, 0.40963.在三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中，從至少12個(gè)細(xì)胞球體中收集了數(shù)據(jù)。g熒光成像顯示肌動(dòng)蛋白（灰色）、vinculin（綠色）和整合素αVβ3（紅色）的表達(dá)。比例尺=200?μm用于10倍照片，20?μm用于放大照片。h在4個(gè)光照周期后，形成FA的細(xì)胞比例明顯更高。具有局灶性粘附的細(xì)胞是3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，每個(gè)實(shí)驗(yàn)3個(gè)球體。（d–f，h）中的數(shù)據(jù)以平均值表示??±??使用非配對(duì)單尾Student t檢驗(yàn)比較每種條件下非照明和照明區(qū)域的S.D.數(shù)據(jù)。

圖4：各種條件下力誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移。

不同NIR功率密度下細(xì)胞球體的熒光圖像。b不同脈沖頻率下細(xì)胞芽長的測量（n?=?33,33、30個(gè)細(xì)胞）。c脈沖頻率刺激下球體的熒光圖像。 *P?=?0.01272, ***P?<?0.001?d不同近紅外功率密度下芽長的測量（n?=?31,32、29個(gè)細(xì)胞）。 **P?=?0.00905, ***P?<?0.001 e不同致動(dòng)器輪廓長度下球體的熒光圖像。f不同致動(dòng)器輪廓長度下的芽長測量（n?=?31,35、30個(gè)細(xì)胞）。 ***P?<?0.001, ns P?=?0.94032 肌動(dòng)蛋白和細(xì)胞核分別顯示為綠色和藍(lán)色。比例尺=100?μm.孵化溫度=25?°C.在每種條件下，在三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中從至少八個(gè)細(xì)胞球體中收集數(shù)據(jù)。使用單因素方差分析（ANOVA）比較不同條件下的數(shù)據(jù)，然后進(jìn)行Tukey的事后檢驗(yàn)。CD-PNIPAM-RGD致動(dòng)器的照明頻率、功率密度或分子量的增加顯著增強(qiáng)了細(xì)胞遷移，然而，超過一定閾值后，分子量的進(jìn)一步增加并沒有帶來額外的改善。

圖5:CD-PNIPAM-RGD和CD-PNIPAM-MRT在強(qiáng)力作用下的不同細(xì)胞遷移模式示意圖。

a用CD-PNIPAM-RGD激活的整合素αvβ3的示意圖和顯示4天內(nèi)細(xì)胞遷移的延時(shí)明場圖像。比例尺：100?μm.b第4天的熒光圖像來自a.比例尺：100μm。c顯示與間充質(zhì)細(xì)胞相比，變形蟲細(xì)胞中SNAI1表達(dá)增強(qiáng)的代表性圖像。比例尺：10?μm.d與變形蟲細(xì)胞相比，間充質(zhì)細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)增強(qiáng)的代表性圖像。肌動(dòng)蛋白的免疫染色圖像以綠色突出顯示，細(xì)胞核（DAPI，4,6-二脒基-2-苯基吲哚）以藍(lán)色突出顯示，SNAI以黃色顯示，E-cadherin以紅色顯示。CD-PNIPAM-RTD激活的整合素αvβ6示意圖和延時(shí)明場照片顯示了4天內(nèi)的細(xì)胞遷移。比例尺：100?μm.f–h施力4天后，定量分析CD-PNIPAM-RGD或CD-PNIPAM-MTD功能化水凝膠中細(xì)胞的細(xì)胞表型分布，用于評(píng)估（f）脈沖頻率、（g）NIR功率密度和（h）致動(dòng)器分子量（Mw）的影響。f–h每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表一個(gè)獨(dú)立的球體（生物復(fù)制，n?=?9 球體/組，3個(gè)實(shí)驗(yàn)）。對(duì)于（f）*P?=?0.01565, *P?=?0.01766,ns=0.62788，ns=0.75417，（g）*P?=?0.03366 *P?=?0.01495, ns P?=?0.97658, ns P?=?0.58146 （h） **P?=?0.00126, *P?=?0.02328, ns P?=?0.84325, ns P?=?0.34575. i–k施力4天后細(xì)胞最大遷移長度的定量分析，用于評(píng)估i脈沖頻率、j近紅外功率密度和k致動(dòng)器分子量（Mw）的影響。（i-k）每種情況的樣本量如下：（i）n?=?54,54、30、65、65、60個(gè)單元格（j）n?=?54,65、30、24、25、60個(gè)單元格（k）n?=?53,從左到右分別取9個(gè)球體中的48、30、51、50、60個(gè)細(xì)胞。對(duì)于（i）*P?=?0.04095, ***P?<?0.001, *P?=?0.04568, **P?=?0.0928,（g）*P?=?0.04611 ***P?<?0.001, *P?=?0.04282, ***P?<?0.001 （h） ***P?<?0.001, ***P?<?0.001, **P?=?0.0764, ***P?<?0.001. f-k中的數(shù)據(jù)以平均值表示??±??使用單因素方差分析（ANOVA）比較不同條件下的S.D.數(shù)據(jù)，然后進(jìn)行Tukey的事后檢驗(yàn)。對(duì)于CD-PNIPAM-RGD致動(dòng)器，增加照明頻率、功率密度和致動(dòng)器分子量會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞MAT和遷移。相比之下，對(duì)于CD-PNIPAM-RTD致動(dòng)器，這些增加改善了細(xì)胞遷移，但沒有顯著影響MAT比。

圖6：整合素-配體相互作用和力誘導(dǎo)解離動(dòng)力學(xué)的計(jì)算分析。

a, b Interactions between the ligand motif and (a) αvβ3 integrin and (b) αvβ6 integrin (RGD/αvβ3 complex Protein Data Bank (PDB) ID: 1L5G, RTD/αvβ6 complex obtained from molecular docking). c The ligand bound to the integrin headpiece in a water box used for equilibration and steered molecular dynamics (SMD) simulations. d Force-induced dissociation trajectory of the ligand from integrin αvβ3 through steered molecular dynamics. The force profiles were obtained from five independent simulations, with the ligand being pulled away from integrin at a speed of v?=?0.06???ps?1 e Average peak force required for dissociation. For every group, the force calculated were from the same initial state of simulation but with different random seeds. The data in (e) is presented as mean values??±??S.D. ***P?=?0.000179.

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總結(jié)與展望

在這項(xiàng)研究中，我們通過將分子致動(dòng)器CD-PNIPAM-RGD結(jié)合到基于葡聚糖的水凝膠中，擴(kuò)展了我們之前的工作，創(chuàng)建了一個(gè)能夠在3D微環(huán)境中對(duì)特定細(xì)胞受體施加局部力的創(chuàng)新平臺(tái)。這些致動(dòng)器利用一種將近紅外（NIR）光轉(zhuǎn)化為熱量的克羅科寧染料（CD）發(fā)色團(tuán)，觸發(fā)熱響應(yīng)性PNIPAM鏈?zhǔn)湛s并對(duì)靶細(xì)胞受體施加張力。利用這一先進(jìn)的系統(tǒng)，我們研究了不同的機(jī)械力參數(shù)——大小、頻率和持續(xù)時(shí)間——如何影響卵巢癌癥Hey細(xì)胞球體的遷移和侵襲行為。為了進(jìn)一步了解特定整合素亞型在這些過程中的作用，我們用兩種不同的亞型特異性配體對(duì)致動(dòng)器進(jìn)行了功能化：αvβ3的RGD和αvβ6整合素的RTD。我們的研究結(jié)果表明，在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的早期階段，機(jī)械力的應(yīng)用會(huì)增強(qiáng)集體細(xì)胞侵襲。此外，我們?cè)诤笃谟^察到顯著的間充質(zhì)到變形蟲的轉(zhuǎn)變（MAT），特別是當(dāng)RGD-αvβ3復(fù)合物受到高頻和高振幅力時(shí)。相反，在相似條件下，通過RTD-αvβ6復(fù)合物刺激的細(xì)胞表現(xiàn)出最小的MAT。分子力學(xué)模擬進(jìn)一步驗(yàn)證了這些觀察結(jié)果，強(qiáng)調(diào)了特定力參數(shù)和整合素相互作用在調(diào)節(jié)細(xì)胞行為中的關(guān)鍵作用。值得注意的是，與其他方法相比，我們的方法具有明顯的優(yōu)勢：雖然光遺傳學(xué)/光機(jī)系統(tǒng)需要基因修飾或侵入性光活化，這會(huì)破壞天然細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，與3D水凝膠在化學(xué)上不相容，而且由于體力傳導(dǎo)（例如通過磁珠或電場），機(jī)電/磁力學(xué)方法通常缺乏分子尺度的精度，但我們的平臺(tái)能夠在3D環(huán)境中以更高的分子精度進(jìn)行精確的非侵入性施力。這種能力使我們的系統(tǒng)成為機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)研究的有力工具，為特定受體亞型介導(dǎo)的初級(jí)機(jī)械刺激與細(xì)胞行為之間的關(guān)系提供了有價(jià)值的見解。因此，該平臺(tái)不僅深化了我們對(duì)細(xì)胞力學(xué)的基本理解，還為開發(fā)靶向治療策略和更復(fù)雜的仿生材料鋪平了道路。

文 獻(xiàn)

Li, B., Fu, Q., Lu, Y. et al. 3D hydrogel platform with macromolecular actuators for precisely controlled mechanical forces on cancer cell migration. Nat Commun 16, 4831 (2025). https://doi.org/10.1038/s41467-025-60062-3

來源：柔性電子與能源