撰文丨廖歡

嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型（SARS-CoV-2）變體由于頻繁突變，其傳染性、傳播性和抗原性不斷變化，呈現(xiàn)出持續(xù)進(jìn)化和多樣化特征，從而增加了診斷與治療的復(fù)雜性，亟需開(kāi)發(fā)具有高靈敏度和廣譜突變適應(yīng)性的檢測(cè)平臺(tái)。盡管逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）和免疫測(cè)定仍被視為金標(biāo)準(zhǔn)，但其對(duì)實(shí)驗(yàn)條件和操作環(huán)境要求較高。

為了解決這一問(wèn)題，近期，來(lái)自湖南大學(xué)的胡小曉副教授的研究團(tuán)隊(duì)，聯(lián)合美國(guó)貝勒醫(yī)學(xué)院的Erxi Wu教授，在Genes & Diseases上合作發(fā)表了題為Dual-mode aptamer-driven biosensing platform for ultrasensitive and mutation-resilient detection of theSARS-CoV-2nucleocapsid protein的研究論文，報(bào)道了一種基于核酸適體,可特異性結(jié)合SARS-CoV-2 N蛋白的超靈敏雙模式檢測(cè)平臺(tái)。這項(xiàng)交叉研究融合了分子生物學(xué)技術(shù)和納米技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)SARS-CoV-2核衣殼（N）蛋白及其突變株的超靈敏和突變適應(yīng)性檢測(cè)。

研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助的X-Aptamer SELEX策略及SPR分析技術(shù)篩選獲得核酸適體NP14。研究團(tuán)隊(duì) 通過(guò)分子對(duì)接、截短和堿基突變實(shí)驗(yàn)，揭示了NP14-N蛋白的相互作用。預(yù)測(cè)結(jié)果表明，NP14主要與N端結(jié)構(gòu)域（NTD）內(nèi)的關(guān)鍵殘基相互作用。此外，在NP14結(jié)構(gòu)方面，其二級(jí)結(jié)構(gòu)包含兩個(gè)關(guān)鍵莖環(huán)區(qū)域 (P1和P2)。圓二色譜證實(shí)，NP14采用B型或發(fā)夾狀DNA結(jié)構(gòu)，而非G-四鏈體結(jié)構(gòu)，這有助于其高選擇性和低非特異性結(jié)合。

為評(píng)估核酸適體NP14的特異性與識(shí)別廣譜性，研究團(tuán)隊(duì)將其與以下一系列代表性蛋白分別進(jìn)行結(jié)合實(shí)驗(yàn)：SARS-CoV-2 N蛋白、SARS冠狀病毒N蛋白、人類(lèi)冠狀病毒HCoV-229E、OC43和HKU1的相關(guān)蛋白、SARS-CoV-2受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（RBD）、甲胎蛋白（AFP）、白細(xì)胞介素-4（IL-4）、牛血清白蛋白（BSA）、流感A和B病毒蛋白（Influenza A、Influenza B）。結(jié)果顯示，NP14與SARS-CoV-2 N蛋白結(jié)合具有很強(qiáng)的特異性且結(jié)合效率最高。在酶聯(lián)寡核苷酸檢測(cè)中，NP14在寬濃度范圍內(nèi)能識(shí)別SARS-CoV-2的α、β、γ、δ、λ和奧密克戎（BA.1、BA.2、B.1.640和BA.4）變體，證實(shí)其具有良好的廣譜識(shí)別能力。這些結(jié)果表明，NP14是一種具有高度特異性、突變適應(yīng)性好的探針，能夠高效率地檢測(cè)各種SARS-CoV-2變體。

在前期報(bào)道中，研究人員已將適體與抗體夾心方法用于小分子或者蛋白檢測(cè)具有良好的特異性和較高的靈敏度。因此，本研究團(tuán)隊(duì)也開(kāi)發(fā)了一種雜交酶聯(lián)免疫測(cè)定法（ELAAA），并將其與標(biāo)準(zhǔn)的雙抗體夾心ELISA進(jìn)行了比較。雜交ELAAA的檢測(cè)限為0.1 ng/mL，而ELISA為0.5 ng/mL。這可能歸因于核酸適體的小尺寸和靈活性，減輕了空間位阻，并且避免了僅用抗體形式觀察到的輕微交叉反應(yīng)，從而減少非特異性結(jié)合背景，提高檢測(cè)靈敏度。這些結(jié)果驗(yàn)證了在夾心系統(tǒng)中添加核酸適體-抗體可以提高抗原檢測(cè)的靈敏度和特異性。

基于這些進(jìn)展，該團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種多色動(dòng)態(tài)光散射增強(qiáng)雜交酶聯(lián)免疫測(cè)定法（MD-ELAAA），將等離子體比色法與動(dòng)態(tài)光散射（DLS）相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了肉眼可視化判讀與定量分析，進(jìn)一步采用病毒培養(yǎng)物對(duì)該平臺(tái)進(jìn)行了一系列評(píng)估。它檢測(cè)到病毒培養(yǎng)物0.43 TCID50/mL，與標(biāo)準(zhǔn)ELISA相比提高了47倍。該MD ELAAA平臺(tái)通過(guò)以下三項(xiàng)創(chuàng)新：（1）其非聚集等離子體傳感使用金納米花（AuNFs）和銀沉積化學(xué)來(lái)提供穩(wěn)定的多色視覺(jué)輸出；（2）其雙顯示模式將快速的肉眼比色信號(hào)與光散射強(qiáng)度的精確DLS量化相結(jié)合；（3）通過(guò)利用NP14的高親和力和突變體適應(yīng)性，該系統(tǒng)也能實(shí)現(xiàn)對(duì)突變體的高效識(shí)別。通過(guò)將可視化檢測(cè)與儀器定量分析途徑相結(jié)合，該MD ELAAA能夠可靠地檢測(cè)出低豐度抗原，兼具即時(shí)檢測(cè)的簡(jiǎn)便性與實(shí)驗(yàn)室級(jí)的檢測(cè)準(zhǔn)確性。

研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)廣泛的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證實(shí)了MD ELAAA檢測(cè)平臺(tái)卓越的分析特性。該平臺(tái)的核心優(yōu)勢(shì)在于其檢測(cè)結(jié)果可通過(guò)肉眼識(shí)別，并且在0.01-5 ng/mL的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)對(duì)目標(biāo)物表現(xiàn)出良好的檢測(cè)性能。與商業(yè)ELISA試劑盒（靈敏度1.4 ng/mL）相比，該MD ELAAA方法的性能優(yōu)于之前大部分報(bào)道的基于核酸適體的檢測(cè)方法。

綜上所述，本研究介紹了一種高親和力核酸適體NP14，可選擇性靶向SARS-CoV-2核衣殼蛋白的保守N端結(jié)構(gòu)域（NTD）。將核酸適體NP14整合到結(jié)合比色法和動(dòng)態(tài)光散射的雙模式MD ELAAA平臺(tái)中，使其靈敏度比傳統(tǒng)ELISA高47倍，并具有強(qiáng)大的變體適應(yīng)性檢測(cè)能力。該研究為新一代高靈敏生物傳感器的開(kāi)發(fā)提供了重要思路，兼顧檢測(cè)的簡(jiǎn)便性與定量準(zhǔn)確性。

原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.gendis.2025.101943

湖南大學(xué)生物學(xué)院博士生周舒為文章第一作者，湖南大學(xué)生物學(xué)院胡小曉副教授和美國(guó)貝勒醫(yī)學(xué)院的Erxi Wu教授為本文的共同通訊作者。該項(xiàng)目由湖南省自然科學(xué)基金（No. 2023JJ30124）和重慶市自然科學(xué)基金（No. CSTB2022NSCQ-MSX1551），福建省自然科學(xué)基金（No. 2023J01247）以及廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No. 2024A1515012771）資助。

制版人：十一

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