2026年2月24日，中醫(yī)藥功能成分發(fā)現(xiàn)與利用國家重點實驗室、中藥標準化重點實驗室、上海中醫(yī)藥大學中藥綜合藥重點實驗室、上海中醫(yī)藥大學中藥研究所、王長虹教授團隊在Journal of Ethnopharmacology (IF=5.4，中科院2區(qū)，Q1)在線發(fā)表題為“Discrimination of the significance of astragalosides in Astragalus radix based on the in vivo exposure levels and pharmacokinetic characteristics of prototype saponins and their metabolites: A strategy for discovering and confirming quality markers”（基于原型皂苷及其代謝物的體內暴露水平和藥代動力學特征，區(qū)分黃芪中黃芪皂苷的重要性：發(fā)現(xiàn)和確認質量標志物的策略）的研究論文。

亮點

?采用超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質譜法同時測定大鼠血漿中的五種黃芪甲苷。

?在大鼠口服給予單個黃芪甲苷后，CA 顯示出最高的血漿暴露量。

?與 ASⅡ 和 ASⅣ 相比，ASⅠ 和 ASⅢ 在胃腸道中轉化為 CA 的速度更快。

?潛在 Q 標記的重要性取決于它們轉化為 CA 的速率和程度。

?體內ADME特性可以作為篩選 Q 標記物的有效策略之一。

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【摘要】

民族藥理學相關性

黃芪（Astragali Radix，AR）是蒙古黃芪（Astragalus membranaceus var. mongholicus (Bge) Hsiao）或黃芪（A. membranaceus (Fisch.) Bge）的干燥根。黃芪在中國已有兩千多年的食用歷史，因其具有健脾益氣的藥用功效，被用作滋補品。黃芪中含有黃芪甲苷Ⅰ（ASⅠ）、黃芪甲苷Ⅱ（ASⅡ）、黃芪甲苷Ⅲ（ASⅢ）、黃芪甲苷Ⅳ（ASⅣ）和環(huán)黃芪醇（CA），這些成分具有多種藥理活性。然而，目前黃芪的質量控制方法主要集中于黃芪甲苷Ⅳ，而忽略了其他黃芪甲苷的作用，因此無法客觀、全面地反映黃芪的質量。
研究目標

本研究旨在通過口服黃芪甲苷后原型皂苷及其代謝物的體內暴露水平和藥代動力學特征，證明主要黃芪甲苷的重要性，為建立以黃芪甲苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ為質量標志物（Q標志物）的多組分質量控制體系提供科學依據。

材料與方法本研究建立了一種超高效液相色譜-電噴霧電離串聯(lián)質譜（UHPLC-ESI-MS/MS）方法，用于全面評價大鼠口服等摩爾劑量的ASⅠ、ASⅡ、ASⅢ、ASⅣ和CA五種主要成分及其水提物（WEA）后的體內行為（藥代動力學參數(shù)）。通過測定這些皂苷成分在體內轉化為CA的速率和程度，確定了它們作為潛在Q標志物的重要性。隨后，建立了一種超高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器（UHPLC-ELSD）方法，并應用于測定AR樣品中ASⅠ、ASⅡ、ASⅢ和ASⅣ的含量。結果UHPLC-ESI-MS/MS 方法具有優(yōu)異的特異性、準確度、精密度和穩(wěn)定性，且基質效應和回收率均可接受。當大鼠口服等摩爾劑量的 ASⅠ、ASⅡ、ASⅢ、ASⅣ、CA 和 WEA 時，最顯著的特征是它們主要以代謝物 CA 的形式存在于血液中?？诜饶杽┝康?ASⅠ、ASⅡ、ASⅢ、ASⅣ、CA 和 WEA 后，由 ASⅠ、ASⅡ、ASⅢ、ASⅣ、CA 和 WEA 轉化而來的 CA 的特征藥代動力學參數(shù)如下：最大峰濃度 (C max ) 分別為 43.73、20.58、100.09、44.20、308.59 和 21.96 ng/mL；達峰時間 (T max ) 分別為 11.33、8.67、6.67、8.00、1.00 和 9.33 h。各組的濃度-時間曲線下面積（AUC (0-t)）分別為600.08、250.92、1032.90、464.18、984.09和173.49 μg/L·h。CA組表現(xiàn)出最快的全身吸收和最高的生物利用度，ASⅢ組的轉化動力學和效率最佳，ASI組緊隨其后，并表現(xiàn)出更長的藥理持久性。相比之下，ASⅣ和ASⅡ組的轉化效率較低，且在循環(huán)系統(tǒng)中可檢測到原型化合物。大鼠口服WEA后，CA的血漿濃度最高，而原型化合物ASⅡ和ASⅣ的含量極低，未檢測到原型化合物ASⅠ或ASⅢ，這證實了與ASⅡ和ASⅣ相比，ASⅠ和ASⅢ在胃腸道中更快地轉化為CA。采用經驗證的UHPLC-ELSD方法測定AR中ASⅠ、ASⅡ、ASⅢ、ASⅣ和CA的豐度，結果順序為：ASⅠ > ASⅡ > ASⅣ ≥ ASⅢ 。結論本研究首次系統(tǒng)地評價和比較了口服等摩爾劑量黃芪甲苷后，黃芪甲苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ在體內轉化為黃芪甲苷（CA）的速率和效率。結果表明，黃芪甲苷Ⅰ和Ⅲ的轉化動力學和效率均優(yōu)于黃芪甲苷Ⅳ和Ⅱ。結合黃芪甲苷在體內的轉化和暴露特征及其在黃芪甲苷中的含量，黃芪甲苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ可作為潛在的多指標標志物，用于控制黃芪甲苷在黃芪甲苷中的質量。主要活性成分的體內ADME過程特征可作為篩選中藥材或其他藥材潛在客觀質量標志物的有效策略之一。。

01

研究背景及科學問題

黃芪（AR）顯著的藥理作用歸因于其生物活性成分，其中皂苷是最具特征性的成分之一。目前已從黃芪中鑒定出約160種皂苷，包括142種環(huán)阿屯烷型三萜皂苷和19種四環(huán)齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷（Peng et al., 2023）。環(huán)阿屯烷型三萜皂苷含有多種苷元，包括環(huán)阿特拉醇（CA）、環(huán)棘霉素和環(huán)加列基寧。其中，CA衍生的黃芪甲苷主要包括黃芪甲苷Ⅰ（ASⅠ）、黃芪甲苷Ⅱ（ASⅡ）、黃芪甲苷Ⅲ（ASⅢ）、黃芪甲苷Ⅶ（ASⅦ）和乙酰黃芪甲苷（AAS）。齊墩果烷型三萜皂苷具有五環(huán)結構，主要以大豆皂苷元為苷元，具有顯著的生物活性，廣泛分布于豆科植物中。AR中主要皂苷的化學結構見補充材料圖S1，圖1展示了主要成分ASⅠ、ASⅡ、ASⅢ、ASⅣ、CA以及代謝中間體環(huán)皂苷（Cyc C）和短皂苷B（Bra B）的化學結構。

圖 1.黃芪甲苷Ⅰ（ASⅠ）、黃芪甲苷Ⅱ（ASⅡ）、黃芪甲苷Ⅲ（ASⅢ）、黃芪甲苷Ⅳ（ASⅣ）、環(huán)黃芪醇（CA）、環(huán)黃芪苷（Cyc C）和短苷B（Bra B）的化學結構。

藥理學研究和臨床試驗表明，黃芪甲苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ具有多種治療作用，包括抗炎（Yang等，2020）、抗氧化（Liu等，2017）、抗凋亡（Xu等，2021）、抗纖維化（Zhang等，2022）和抗腫瘤活性（Sheng等，2024）。近年來，黃芪甲苷苷元（CA）的藥理活性也日益受到關注。除了其已知的抗炎和免疫刺激作用外，CA還因其端粒酶激活特性和潛在的抗衰老應用而備受研究關注（Molgora等，2013）。

為了提升中國中藥產品的質量和質量控制標準，劉等人于2016年提出了中藥質量標志物（Q-markers）的新概念（Zhang et al., 2017 , 2018 , 2019）。該概念針對中藥體系的獨特特征，包括其生物學特性、生產工藝和方劑理論。Q-markers的基本標準定義如下：中藥材及其制品中固有的次生代謝產物，或在加工制備過程中形成的化學物質；特定中藥材（或其加工制劑）所特有的、不來源于其他中藥材的化學物質；具有明確的化學結構和生物活性；能夠進行定性鑒定和定量分析；根據中藥方劑配伍原則，優(yōu)先選擇“主藥材”。藥物通過特定的給藥途徑進入血液循環(huán)，經過代謝和分布，產生特定的生物學效應。因此，進入血液循環(huán)的成分及其代謝產物才是最終的“活性成分”。從質量傳遞和可追溯性的角度來看，血液中的活性成分代表了質量傳遞體系的最終階段，也是確定中藥質量指標的關鍵依據。

在過去的四十年里，包括現(xiàn)行的2025版《中國藥典》，黃芪甲苷（ASIV）一直被用作黃芪甲苷類化合物（AR）的質量控制物質（Yang，2023；Yu等，1986；Zhang等，2010）。歷史上，黃芪甲苷測定的樣品前處理方法涉及復雜且耗時的提取步驟。盡管方法不斷改進，但樣品前處理過程仍然費力且效率低下。Zuo等（ Zuo，2022 ）在所檢測的黃芪甲苷樣品中鑒定出黃芪甲苷Ⅰ、黃芪甲苷Ⅱ和芒柄花苷是含量最高的三種成分。Dan等（ Dan，2023 ） Chen等人（2023）和Dan（2023）對多個黃芪樣品進行了全面的含量測定，結果表明，不同栽培年份和生長模式下，黃芪甲苷的含量呈現(xiàn)一致的順序，即ASⅠ > ASⅡ > ASⅢ ≥ ASⅣ，其中ASⅠ和ASⅡ在藥材中的含量顯著高于ASⅣ。值得注意的是，添加氨水作為提取溶劑可使ASⅠ、ASⅡ以及其他黃芪甲苷發(fā)生定量和定性轉化，轉化為ASⅣ。然而，這種轉化過程并不完全，通過這種非環(huán)保方法獲得的ASⅣ含量無法準確反映黃芪的真實品質（Liu等人，2022）。由于黃芪藥材中黃芪甲苷含量較低，因此難以直接從黃芪中提取和分析。目前制備檸檬酸（CA）的方法主要包括通過酸水解（Chu et al., 2019）、Smith降解（Feng et al., 2014）、酶水解（Cheng et al., 2020 ; Li et al., 2019）或微生物轉化（Takeuchi et al., 2022）等途徑轉化ASIV。然而，這些方法受限于高昂的生產成本和環(huán)境污染問題。雖然人們已經探索了更環(huán)保的酵母合成方法，但尚未成功應用。因此，檸檬酸仍然不適合作為抗性（AR）的質量標志物（Yuan et al., 2023）。

本文系統(tǒng)綜述了黃芪甲苷和CA在體內外的代謝轉化和藥代動力學特征，詳見補充材料圖S2。大多數(shù)黃芪甲苷在中性條件下保持穩(wěn)定，而AAS、ASⅠ、ASⅡ以及異黃芪甲苷Ⅰ（iso-ASI）、異黃芪甲苷Ⅱ（iso-ASⅡ）在酸性或堿性條件下會轉化為ASⅣ（Chu et al., 2014）。黃芪甲苷的生物轉化途徑包括腸道菌群、真菌和酶促途徑，通過脫乙?；?、脫糖基化和脫氫反應，生成環(huán)苷B（Cyc B）、短苷B（Bra B）、CA、異環(huán)黃芪醇（iso-CA）和脫氫環(huán)黃芪醇等代謝產物（Li et al., 2024）。值得注意的是，乳桿菌和雙歧桿菌菌株主要介導黃芪甲苷（ASⅣ）向黃芪甲苷（CA）的轉化，其中C-6葡萄糖水解被認為是CA的潛在限速步驟（Takeuchi et al., 2022 ; Zhou et al., 2012）。黃芪甲苷在體內的主要代謝部位是胃腸道，其主要代謝途徑包括脫糖基化、甲基化、脫乙?；瓦€原（Jin et al., 2015）。

對于CA而言，肝臟是主要的代謝器官，介導包括脫氫、脫羥基和脫水在內的氧化轉化。這些代謝修飾主要發(fā)生在9,19-環(huán)丙烷環(huán)和20,24-呋喃環(huán)部分（He et al., 2022 ）。目前的藥代動力學研究表明，ASⅠ和ASⅡ在體內首先代謝為ASⅣ ，隨后ASⅣ脫糖基化形成CA，進入體循環(huán)發(fā)揮藥理作用。當大鼠口服總黃芪甲苷或ASⅠ和ASⅡ的單體化合物時，給藥物中ASⅠ和ASⅡ的含量顯著高于ASⅣ。然而，在血漿中檢測到的ASⅣ濃度高于其他黃芪甲苷。因此，既往研究一致認為，黃芪甲苷主要通過在體內轉化為ASⅣ發(fā)揮其藥理作用（Guo et al., 2019）。值得注意的是，單體黃芪甲苷IV（ASⅣ）給藥后，血漿中可檢測到黃芪甲苷（CA）和異構體黃芪甲苷（iso-CA），其中CA的血漿濃度和生物利用度均高于ASⅣ。這些發(fā)現(xiàn)強烈提示CA可能是黃芪甲苷發(fā)揮藥理作用的主要生物活性代謝物（He et al., 2018）。Meng et al.（2018）研究了人腸道菌群將ASⅠ、ASⅡ、ASⅢ和ASⅣ轉化為CA的相對轉化效率，揭示了以下代謝層級：ASⅢ > ASⅠ > ASⅡ > ASⅣ。體外腸道菌群研究中觀察到的ASⅠ和ASⅢ轉化為CA的轉化率和效率高于ASⅡ和ASⅣ，表明體內黃芪甲苷生物轉化存在其他代謝途徑。因此，各黃芪甲苷轉化為CA的動力學和效率是選擇最佳AR質量標志物的關鍵參數(shù)。

本研究首先旨在探討大鼠口服等摩爾劑量的黃芪甲苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、CA及黃芪水提取物（WEA，以總黃芪甲苷含量計算）后，不同黃芪甲苷在體內的作用，隨后測定不同時間點血漿中母體化合物及其代謝物的濃度?？紤]到這些皂苷成分在體內轉化為CA的速率和程度，本研究確定了它們作為潛在質量標志物的重要性。最后，通過對多批次黃芪樣品中黃芪甲苷含量的定量分析，本研究充分證實了選擇多種成分作為黃芪質量標志物的合理性。

02

重要發(fā)現(xiàn)及亮點

3.1樣品制備方法和儀器條件的優(yōu)化

在藥代動力學研究中，生物樣品通常濃度較低且含有多種干擾物質。為了最大限度地減少雜質干擾并改善分析環(huán)境，樣品通常需要在測量前進行分離、純化和富集等預處理步驟。常用的樣品預處理方法包括：蛋白質沉淀、液液萃取、固相萃取和化學衍生化（Tao et al., 2018）。經比較，蛋白質沉淀法被認為是最合適的。優(yōu)化的樣品預處理方法如下：將CS或QC溶液（50 μL）與空白血漿（50 μL）和內標（IS，50 μL）混合，然后加入乙腈（800 μL）作為蛋白質沉淀劑。如圖S3所示（見補充材料），在考察該方法的基質效應時，最初僅加入200 μL乙腈進行樣品蛋白質沉淀。研究發(fā)現(xiàn)，ASⅠ和ASⅡ的基質效應始終低于規(guī)定范圍，且在樣品中觀察到ASⅠ和ASⅡ向其異構體（iso ASⅠ和iso ASⅡ）的轉化。相比之下，未經處理的QC和CS溶液中未發(fā)生此類轉化。推測ASⅠ和ASⅡ的轉化是由蛋白質沉淀不完全引起的。目前尚無相關文獻報道證實這一現(xiàn)象。為了降低基質效應，對樣品預處理過程的每個步驟進行了優(yōu)化（Qu et al ., 2014 ; Shaw et al., 2012 ; Xu et al., 2013）。首先，考察了沉淀劑的種類。與甲醇和甲醇：乙腈（1:1）相比，乙腈具有更強的蛋白質沉淀能力，能夠抑制分析物的轉化，如圖S4所示（見補充材料） 。其次，沉淀劑的用量也是一個關鍵因素，我們測試了200~800 μL乙腈的沉淀效果。補充材料圖S5的結果表明，800 μL乙腈的效果最佳。在氮氣吹掃過程中，溫度可能影響分析物的催化轉化（Zheng et al., 2014 ）。如圖S6所示，在室溫（約25 °C）水浴中，分析物的轉化率低于37 °C時的轉化率。最后，我們測試了復溶溶劑的類型。補充材料圖S7展示了用乙腈或50%乙腈水溶液復溶干燥樣品的效果，結果表明50%乙腈水溶液明顯更合適。

優(yōu)化色譜條件以增強分析物峰的響應。對流動相進行了研究。研究表明，在流動相中添加甲酸可以促進分析物的電離（Gao et al., 2005）。補充材料圖S8比較了分別以甲酸水和水為流動相時分析物的響應強度。研究結果表明，與純水相比，使用甲酸水作為流動相可以獲得更好的分析物響應。

MS 2掃描模式表明，所有分析物和內標的電離在正離子模式下的相對強度均遠高于負離子模式。接下來，通過生產模式優(yōu)化了包括碰撞能量（CE）、去簇電壓（DP）和碎裂器在內的質譜參數(shù)。優(yōu)化結果如表1所示。

表 1.五種分析物和內標的優(yōu)化 MRM 參數(shù)。

3.2方法驗證3.2.1 .特異性、線性度

圖2顯示了空白血漿、添加工作溶液的空白血漿樣品以及WEA組大鼠口服給藥后血漿樣品的MRM色譜圖。ASⅠ、ASⅡ、ASⅢ、ASⅣ、CA和IS的保留時間分別約為4.36、3.79、3.61、3.62、4.85和3.78 min。分析物和IS分離良好，血漿中的內源性物質不干擾待測成分的測定。

圖 2.空白血漿 (A) 的代表性 UHPLC-ESI-MS/MS 色譜圖；添加工作溶液 (500 ng/mL) 的空白血漿 (B)；口服 WEA 后的血漿樣品 (C) 的代表性 UHPLC-ESI-MS/MS 色譜圖。

表2總結了所有分析物的校準曲線和定量下限（LLOQ）。所有校準曲線均表現(xiàn)出良好的線性，相關系數(shù)（r2 ）在0.9962至0.9996范圍內。這些定量下限適用于藥代動力學研究中分析物的定量檢測。

3.2.2精密度和準確度

表3列出了質控樣品的日內和日間精密度和準確度。日內精密度（RSD）范圍為2.27%至13.42%，準確度（RE）范圍為-12.81%至10.45%。日間精密度（RSD）范圍為3.48%至11.23%，準確度（RE）范圍為-6.50%至3.57%。所有日間和日內精密度和準確度均符合生物介質實驗的要求。

3.2.3 .恢復和基質效應

如表 4所示，三種濃度下五種分析物的提取回收率（97.36% – 107.33%）和基質效應（88.28% – 104.41%）均在可接受的范圍內。

3.2.4穩(wěn)定性

穩(wěn)定性實驗結果表明，未發(fā)生明顯的降解，結果匯總于表4。數(shù)據表明，大鼠血漿中的所有分析物在?80 °C下儲存30天、經歷三次凍融循環(huán)以及在室溫下放置24小時后均保持穩(wěn)定。

3.3藥代動力學研究和生物轉化分析

上述經驗證的UHPLC-ESI-MS/MS方法成功應用于測定大鼠口服等摩爾劑量（1.5 mM）的ASⅠ、ASⅡ、ASⅢ、ASⅣ和CA以及1.22 mM WEA（由ASⅠ、ASⅡ、ASⅢ和ASⅣ的總和計算得出）后血漿中五種分析物的濃度。圖3展示了分析物的平均血漿濃度-時間曲線。表5列出了大鼠口服ASⅠ、ASⅡ、ASⅢ、ASⅣ、CA和WEA后，分析物原型及其代謝物的平均血漿濃度。表6列出了藥代動力學參數(shù)。

圖 3.口服1.5 mM ASⅠ、(B) 1.5 mM ASⅡ、(C) 1.5 mM ASⅢ、(D) 1.5 mM ASⅣ、(E) 1.5 mM CA 和 (F) 1.22 mM ASⅠ、ASⅡ、ASⅢ、ASⅣ 總濃度后，原型化合物及其代謝物的平均血漿濃度-時間曲線（WEA 中）。（Met. 代表代謝物）。

圖3和表5、表6的對比分析表明，大鼠口服ASI、ASⅡ、ASⅢ、ASⅣ、CA和WEA后，各處理組均出現(xiàn)不同程度的代謝轉化，轉化為CA，且各組轉化率和轉化效率存在顯著差異。根據黃芪甲苷的結構復雜性，從最簡單的分子構型到最復雜的分子構型，系統(tǒng)地研究了其藥代動力學參數(shù)和生物轉化特征。

圖3A展示了大鼠直接口服1.5 mM CA后的平均血漿濃度-時間曲線。藥代動力學參數(shù)包括AUC(0-t)為984.09 μg/L·h，Cmax為308.59 ng/mL，Tmax為1.00 h，t1/2Ke為1.86 h，t1/2KaTmax、t1/2Ke和t1/2Ka最短，AUC(0-t)Cmax最高。CA作為黃芪甲苷的常見苷元，具有低分子量和高滲透性，能夠迅速被吸收進入體循環(huán)。這些結果證實 CA 是一種具有高口服生物利用度的生物活性成分。

圖3E顯示了大鼠口服1.5 mM ASⅣ后的血漿濃度-時間曲線，表明ASⅣ和CA均存在于體循環(huán)中。ASⅣ的血漿濃度-時間曲線呈現(xiàn)雙相吸收特征，提示可能存在腸肝循環(huán)。ASⅣ最早在0.083 h即可檢測到，而CA在1 h后出現(xiàn)，表明ASⅣ代謝產生的CA進入體循環(huán)至少需要1 h。 ASⅣ及其代謝物CA的藥代動力學參數(shù)如下：AUC(0-t)值分別為166.71和464.18 μg/L·h，Cmax分別為39.42和44.20 ng/mL，Tmax分別為2.67和8.00 h，t1/2Ke分別為5.89和3.48 h，t1/2Ka分別為0.53和1.44 h，Ka分別為2.20和0.64 L/h，Ke分別為0.28和0.24 L/h。結果表明，ASⅣ代謝產物CA的吸收和消除速率低于母體化合物ASⅣ，但AUC(0-t)和Cmax值ASⅣ，提示口服給藥后ASⅣ可能主要通過在體循環(huán)中大量轉化為CA發(fā)揮其藥理作用。在ASⅣ處理組中，代謝產物CA在給藥后8小時CmaxTmax比CA處理組延長了8倍。這種Tmax的延長表明ASⅣ在胃腸道內的轉化緩慢，提示其代謝轉化需要更長的時間。據推測，ASⅣ的逐漸水解使得部分母體化合物能夠進入體循環(huán)。此外，在等摩爾劑量下，ASⅣ代謝產生的CA的平均血漿濃度和AUC(0-t)均顯著低于CA處理組，表明與直接給予CA相比，ASⅣ的生物利用度降低。

圖3C顯示了大鼠口服1.5 mM ASⅡ后，母體化合物ASⅡ及其代謝物ASIV和CA的血漿濃度-時間曲線。血漿濃度-時間曲線顯示，ASⅡ及其代謝物ASIV均維持在較低的血漿濃度水平，并呈現(xiàn)多峰模式，提示可能存在腸肝循環(huán)或多個腸道吸收位點。與ASIV組類似，母體化合物ASⅡ最早在0.083 h即可在大鼠血漿中檢測到，代謝物ASIV在0.25 h出現(xiàn)，而代謝物CA則在1 h后才被檢測到。由于ASⅡ給藥組中ASⅣ的血漿樣本數(shù)據有限，因此無法對ASⅣ進行可靠的藥代動力學分析。大鼠口服1.5 mM ASⅡ后，ASⅡ和CA的藥代動力學參數(shù)如下：AUC(0-t)值分別為34.67和250.92 μg/L·h，Cmax值分別為16.64和20.58 ng/mL，Tmax值分別為1.17和8.67 h，t1/2Ke分別為2.73和6.06 h，t1/2Ka值分別為0.04和1.90 h，Ka值分別為23.54和0.76 1/h，Ke值分別為0.16和0.14 1/h。代謝物CA的AUC(0-t)和Cmax值均高于母體化合物ASⅡ和代謝物ASⅣ。這證實ASⅣ可能主要作為中間體發(fā)揮作用，或者只有極少量的ASⅡ轉化為ASⅣ。根據代謝物在血漿中出現(xiàn)的時間推斷CA的生成途徑：與ASⅣ相比，ASⅡ在C-3木糖位點多了一個乙?；??？诜嗀SⅡ后，體內生成ASⅣ。隨后，ASⅣ進一步水解，去除糖基，生成CA。同時，部分ASⅡ可能直接失去木糖基，生成中間體Bra B，后者隨后失去葡萄糖基，生成CA。通過這種轉化產生的CA進入體循環(huán)，是ASⅡ發(fā)揮藥理作用的主要途徑。ASⅡ和ASⅣ給藥組的代謝譜和藥代動力學特征高度相似。然而，ASⅡ組的母體化合物吸收和消除速率均低于ASⅣ組，表明ASⅡ在胃腸道內水解和轉化為CA的過程較為緩慢，涉及多個轉化步驟。在等摩爾給藥條件下，ASⅡ 組中代謝生成的 CA 的平均血漿濃度和 AUC(0-t)不僅低于 ASⅣ 組，而且明顯低于 CA 組。

圖3B顯示了大鼠口服1.5 mM ASⅠ后，母體化合物ASⅠ及其代謝物ASⅡ、ASⅣ和CA的血漿濃度-時間曲線。值得注意的是，在ASⅠ給藥組的任何血清樣本中均未檢測到母體化合物ASⅠ或ASⅡ，表明口服給藥后ASⅠ可能發(fā)生快速轉化或具有較高的轉化效率。ASⅣ僅在12小時采樣點可定量，數(shù)據不足以計算其藥代動力學參數(shù)。CA在1小時內即可檢測到，其Cmax為43.73 ng/mL，Tmax為11.33 h，AUC(0-t)為600.08 μg/L·h，t1/2Ke為3.71 h，t1/2Ka為3.39 h，Ka為0.22 1/h，Ke為0.18 1/h。與ASⅡ和ASⅣ給藥組相比，ASⅠ代謝產生的CA在相似的時間點出現(xiàn)在血漿中。其Cmax顯著高于ASⅡ組，其AUC(0-t)也顯著高于ASⅡ和ASⅣ組。吸收和消除所需時間較長，表明血清樣本中未檢測到ASⅠ和ASⅡ母體化合物更可能是由于ASⅠ的高轉化率所致。ASⅣ可能是體內轉化過程中產生的中間代謝物，也可能是ASⅠ代謝為ASⅣ的極小部分。ASⅠ給藥后，CA仍然是血漿中檢測到的主要代謝物。

與ASⅣ相比，ASⅠ的化學結構中C-3木糖部分多出兩個乙酰基。因此，口服ASⅠ后，體內會發(fā)生脫乙?；磻葾SⅡ和ASⅣ。ASⅣ進一步水解去除糖基，生成CA（Wen等，2008）。另一種可能是，ASⅠ直接失去木糖部分形成中間體Bra B，Bra B隨后失去葡萄糖部分生成CA。Zhou等（2012）發(fā)現(xiàn)，在ASⅣ于胃腸道轉化為CA的過程中，C-3木糖基團的去除速度快于C-6葡萄糖基團，其中C-6葡萄糖基團的去除是限速步驟。與ASII和ASIV給藥組相比，ASI可能由于其C-3木糖殘基上的兩個乙?；黾涌臻g位阻，從而抑制脫乙?；⒅苯尤コ咎切纬葿ra B中間體，最終導致CA生成效率更高。這也解釋了為什么ASⅠ代謝產生的CA在與ASⅡ和ASⅣ組相似的時間點出現(xiàn)在血漿中，但轉化率更高。

圖3D顯示了大鼠口服1.5 mM ASⅢ后，母體化合物ASⅢ及其代謝物CA的平均血漿濃度-時間曲線（ASⅢ具有C-3二糖結構，不含C-6葡萄糖基，不會轉化為ASⅣ）。在ASⅢ給藥組的所有樣本中均未檢測到母體化合物ASⅢ。其代謝物CA的藥代動力學參數(shù)如下：AUC(0-t)為1032.90 μg/L·h，Cmax為100.09 ng/mL，Tmax為6.67 h，t1/2Ke為2.92 h，t1/2Ka為1.74 h，Ka為0.49 1/h，Ke為0.26 1/h。與ASⅠ、ASⅡ和ASⅣ給藥組相比，ASⅢ的轉化關系更為簡單。該組不僅獲得了與CA給藥組相當?shù)腁UC(0-t)，而且與ASⅠ、ASⅡ和ASⅣ組相比，其Cmax顯著更高，Tmax、t1/2Ke和t1/2Ka更短。盡管ASⅢ和ASⅣ是異構體，但糖苷鍵的位置異構導致口服給藥后藥代動力學存在如此顯著的差異。這些結果進一步支持了C-3取代基影響ASⅠ組代謝轉化的假設。在等摩爾劑量下，ASⅢ組表現(xiàn)出極高的CA轉化效率和更快的轉化速率。

圖3F顯示了大鼠口服1.22 mM總濃度的ASⅠ、ASⅡ、ASⅢ、ASⅣ（溶于WEA溶液中）后體內ASⅠ、ASⅡ、ASⅢ、ASⅣ和CA的暴露情況。在ASⅢ給藥組中，濃度高達1.5 mM的ASⅢ被有效轉化為CA。血漿樣本中未檢測到ASⅢ母體化合物。因此，在僅含有0.12 mM ASⅢ的WEA給藥組中檢測到的對應于785.5/143.2離子對的峰可以推斷來源于ASⅣ。

實驗結果表明，在WEA給藥組采集的血漿樣本中未檢測到ASⅠ和ASⅢ原型。雖然在樣本中檢測到痕量的ASⅡ和ASⅣ，但ASⅡ的數(shù)據不足以進行藥代動力學參數(shù)計算。ASⅣ和CA的藥代動力學參數(shù)分別為：AUC (0-t)值分別為47.35和173.49 μg/L·h，Cmax值分別為19.13和21.96 ng/mL，Tmax值分別為5.33和9.33 h，t1 /2Ke值分別為24.52和42.09 h，t1 /2Ka值分別為18.97和13.34 h，Ka值分別為2.87和0.90 1/h，Ke值分別為0.77和0.06 1/h。 WEA 給藥組不含 CA，但血漿中 CA 的平均濃度最高，證實 CA 是由其他黃芪甲苷通過體內生物轉化而形成的衍生物，并且其吸收和消除速度很慢。

ASⅣ既是WEA中的原型化合物，也是ASⅠ和ASⅡ轉化而來的潛在代謝產物。因此，其藥代動力學行為無法準確測定。本研究只能通過結合ASⅣ組和WEA治療組的血漿ASⅣ濃度和藥代動力學參數(shù)，推斷WEA組中ASⅣ的吸收和轉化情況?；赪EA組中ASⅣ的含量，利用ASⅣ給藥組中ASⅣ的AUC (0-t)和Cmax值進行粗略轉換，結果表明WEA組中由ASⅣ母體化合物貢獻的ASⅣ的AUC (0-t)和Cmax值分別約為27.79 μg/L·h和6.57 ng/mL，顯著低于ASⅣ的實測值。這表明WEA組中含有ASⅣ代謝產物，這些代謝產物是通過ASⅠ和ASⅡ的大量代謝轉化而來的。 WEA中ASⅡ的濃度最高，因此WEA給藥組在轉化為CA時的藥代動力學行為，如AUC (0-∞)和Cmax，與ASⅡ給藥組非常相似。基于上述實驗結果，推斷ASⅠ和ASⅢ給藥組中的ASⅠ和ASⅢ能夠被高效快速地代謝生成CA。然而，WEA給藥涉及多種化合物的聯(lián)合吸收和藥理作用，因此難以完全復制單化合物組中觀察到的轉化結果。此外，WEA中較高濃度的ASⅡ和ASⅣ的存在，值得進一步研究其涉及的具體化學反應、轉化關系和轉化效率。

圖4展示了ASI、ASⅡ、ASⅢ、ASIV和WEA組與CA組數(shù)據比較所得的典型藥代動力學參數(shù)比值。CA組的Cmax和Tmax值表明CA吸收迅速且生物利用度高，提示該化合物可能是黃芪甲苷發(fā)揮藥理作用的活性代謝物。ASⅠ、ASⅡ、ASⅢ和ASⅣ組的比較分析揭示了以下規(guī)律：基于Cmax ： ASⅢ > ASⅠ > ASⅣ > ASⅡ；基于AUC (0-t)：ASⅢ > ASⅠ > ASⅣ > ASⅡ；基于Tmax ： ASⅢ > ASⅣ > ASⅡ > ASⅠ。這些結果表明，ASⅢ轉化為CA的轉化率最高，其次是ASⅠ。Tmax的排序進一步表明ASⅢ的代謝轉化速度也最快。值得注意的是，ASⅠ不僅能快速轉化為CA，而且還能保持較長時間的轉化活性。在所有評估參數(shù)中，WEA 組的轉化動力學和效率與 ASⅡ 組相似。

圖 4. ASI 、ASⅡ、ASⅢ、ASIV 和 WEA 組相對于 CA 組的藥代動力學參數(shù) AUC (0-t) (A)、T max (B) 和 C max (C) 比率。

與已有的黃芪甲苷藥代動力學研究相比，本實驗結果首先證實，等摩爾劑量口服給藥后，黃芪甲苷（包括ASⅠ、ASⅡ、ASⅢ和ASⅣ）在體內可大量轉化為CA。ASⅣ僅是該轉化過程中的少量中間體。CA的AUC (0-∞)和Cmax值顯著高于其他黃芪甲苷，提示其可能是體內發(fā)揮藥理作用的主要活性成分。其次，ASⅠ和ASⅢ給藥組的CA水平高于ASⅡ和ASⅣ給藥組，這一實驗觀察結果挑戰(zhàn)了ASⅣ是治療功效核心成分的觀點。

在等摩爾劑量下，ASⅡ和ASⅣ的轉化效率顯著低于ASⅠ和ASⅢ組。ASⅢ具有C-3二糖結構，不含C-6葡萄糖基；ASⅠ在C-3木糖基的C-2″和C-3″位均含有乙?；鳤SⅡ僅在C-2″位被乙?；?。從電子角度來看，ASⅠ中兩個相鄰的乙?；赡軐е卖驶–=O）的輕微共軛或極化，從而略微增加羰基氧上的負電荷密度。然而，這種電子效應相對較弱，對分子穩(wěn)定性幾乎沒有實際影響。空間位阻和構象分析表明，ASⅠ的雙乙酰化結構限制了糖鏈的柔性，增加了空間位阻，從而降低了其對水解或酶促反應的敏感性。這種雙重乙?；Ｗo增強了ASⅠ的穩(wěn)定性。相比之下，單乙?；腁SⅡ由于空間位阻減小，結構暴露程度更高，更容易受到親核攻擊。化學微環(huán)境分析表明，ASⅠ的二乙酰化結構缺乏氫鍵供體，疏水性更強，這可能阻礙水分子接近。此外，二乙?；瘶嬓偷倪^渡態(tài)能量更高，有助于增強結構穩(wěn)定性。ASⅠ的二乙?；档土四咎堑娜嵝裕@種構象可能與糖苷酶的活性中心相匹配，從而在脫乙?；葾SⅡ和ASⅣ之前，快速將木糖基化轉化為Bra B單糖苷中間體，使ASⅠ能夠更有效地轉化為CA。

最后，圖5展示了各種黃芪甲苷在體內的預測代謝轉化途徑。圖中藍色區(qū)域（圖5A）代表原型黃芪甲苷化合物，黃色區(qū)域（圖5B）代表轉化過程中的關鍵中間產物，粉色區(qū)域（圖5C）代表快速吸收并進入體循環(huán)的代謝物。藍色實線表示本研究預測的最佳轉化途徑，綠色虛線表示可能同時發(fā)生的其他代謝途徑。

圖 5.預測黃芪甲苷在體內的轉化途徑。

值得注意的是，本研究采用等摩爾劑量法，在體內考察并比較了不同黃芪甲苷成分轉化為CA的速率和程度。同時，本研究還考察并比較了WEA給藥后母體化合物及其代謝產物CA的暴露特征。盡管WEA中ASⅠ、ASⅡ、ASⅢ和ASⅣ的總含量僅為1.22 mM，但黃芪甲苷（AR）中所含皂苷不僅限于這四種類型，還包括其他皂苷（Peng et al., 2023）。因此，可以推斷WEA中皂苷的總劑量可能達到甚至超過1.5 mM，從而能夠與單皂苷給藥組進行比較分析。

3.4 .基于Q標記選擇策略的黃芪甲苷含量測定

為了確定AR中黃芪甲苷的原始含量，并根據中藥質量指標選擇中的可測性原則，對不同批次的AR樣品進行了含量測定。同時，采用新建立的方法（NeM）（Jiang等，2026）和《中華人民共和國藥典》（ChP）中黃芪甲苷Ⅳ的樣品制備方法（藥典委員會，2025）對樣品進行同步制備。

本研究成功應用NeM方法定量分析了22批AR樣品中ASⅠ、ASⅡ、ASⅢ和ASⅣ的含量。樣品信息見補充材料表S1。方法詳情和含量測定結果見補充材料。采用NeM方法測定ASI、ASⅡ、ASⅢ和ASⅣ的含量結果見補充材料表S2和圖6。ASI、ASⅡ、ASⅢ和ASⅣ含量之間的Pearson相關性分析結果見補充材料表S3。采用ChP方法測定ASⅣ和芒柄花素-7-O-β-D-葡萄糖苷的含量結果見補充材料表S4。定量分析表明，不同種植年份和產地AR樣品中黃芪甲苷的含量順序一致為：ASⅠ > ASⅡ > ASⅣ ≥ ASⅢ。值得注意的是，ASⅠ是AR藥材中含量最高的黃芪甲苷，顯著高于其他黃芪甲苷。結合藥代動力學研究結果，雖然黃芪甲苷（ASI）、黃芪甲苷Ⅱ、黃芪甲苷Ⅲ和黃芪甲苷Ⅳ均可轉化為黃芪甲苷（CA），但它們的轉化率和轉化效率各不相同，其發(fā)揮藥理作用的途徑相似。NeM法能夠同時測定多種黃芪甲苷，因此ASI、ASⅡ、ASⅢ和ASⅣ可作為多種質量指標，用于評價黃芪甲苷的質量。

圖 6.采用NeM 方法測定 ASI、ASⅡ、ASⅢ 和 ASⅣ 的含量結果。

分別采用NeM法和ChP法的色譜條件測定ChP法制備的樣品中的含量。含量測定結果如圖7所示，相關性分析結果如圖8所示。

圖 7. ChP和 NeM 方法的含量測定結果。

圖 8. NeM方法和 ChP 方法所得含量測定結果的相關性分析。

相關性分析結果（圖 8）表明，對于使用 ChP 方法制備的樣品，ChP 和 NeM 方法得到的結果一致，進一步證明了 NeM 方法的準確性和實用性。

【Citation】:Jiang H, Liu W, Zheng L, et al. Discrimination of the significance of astragalosides in Astragalus radix based on the in vivo exposure levels and pharmacokinetic characteristics of prototype saponins and their metabolites: A strategy for discovering and confirming quality markers[J].Journal of Ethnopharmacology,2026: 121415.

【貢獻】★★★★★

本藥代動力學研究首次系統(tǒng)地評價和比較了體內黃芪甲苷（ASI）、黃芪甲苷（ASⅡ）、黃芪甲苷（ASⅢ）和黃芪甲苷（ASⅣ）代謝轉化為黃芪甲苷（CA）的速率和效率。值得注意的是，與黃芪甲苷（ASⅣ）和黃芪甲苷（ASⅡ）相比，黃芪甲苷（ASⅢ）表現(xiàn)出更優(yōu)異的轉化動力學和轉化效率。WEA組的藥代動力學行為值得進一步研究。含量測定結果表明，AR樣品中黃芪甲苷的含量順序為：ASⅠ > ASⅡ > ASⅣ ≥ ASⅢ。由于ChP方法采用ASⅣ作為AR的Q標記物，因此需要添加氨水將ASⅠ和ASⅡ轉化為ASⅣ。這種方法既復雜又違背了環(huán)境可持續(xù)性原則。相比之下，NeM方法則簡便、快速且準確。

本研究表明，ASI、ASⅡ、ASⅢ和ASⅣ均滿足中藥質量指標選擇五項標準中的功效和可測量性原則，因此ASI、ASⅡ、ASⅢ和ASⅣ可作為評價AR質量的多個質量指標。

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