近年來，單細胞轉錄組和空間轉錄組技術的突破為植物與病原物互作研究帶來了前所未有的精度提升：前者能夠在單個細胞水平上解析基因表達，揭示植物應答病原侵染時的細胞異質性；后者則能夠繪制基因在組織內的空間表達圖譜，追蹤特定位置和時間下的轉錄動態(tài)。兩者的整合為解析植物免疫的分子機制提供了全新視角，直觀地揭示了不同細胞類型和組織區(qū)域如何協(xié)同應對外界脅迫。由多堆柄銹菌（Puccinia polysora, P. p）侵染引起的玉米南方銹病，是威脅全球玉米生產的重要病害，嚴重時可導致減產50%以上。病原菌通過玉米葉片表面侵入，在植株系統(tǒng)性擴展，破壞光合作用，影響籽粒灌漿。盡管已有多個南方銹病基因被鑒定，但玉米如何在不同細胞類型和組織層面協(xié)調免疫響應，一直是尚未解析的關鍵問題。

近日，河南省農業(yè)科學院糧食作物研究所曹言勇團隊聯(lián)合河南農業(yè)大學植物保護學院施艷團隊、中國農業(yè)科學院作物科學研究所段燦星團隊在Advanced Science期刊在線發(fā)表題為“Integrated Single-Cell and Spatial Transcriptomics Reveal Cell-Type- Specific Immune Regulatory Networks in Maize Responding to Southern Corn Rust”的研究論文， 該研究整合單細胞核轉錄組和空間轉錄組技術，構建了玉米應答南方銹病侵染早期的高分辨率時空轉錄圖譜。首次系統(tǒng)描繪了8種主要葉片細胞類型在病原菌侵染過程中的轉錄動態(tài)，揭示了表皮細胞和葉肉細胞在早期免疫中的核心作用，并明確了不同細胞類型在免疫響應中的功能分工。并挖掘出了ZmXET1和ZmRBG為玉米防御南方銹病的關鍵基因，為抗病育種提供了有價值的靶點。

1. P. p在玉米幼苗葉片中的侵染建立

通過系統(tǒng)的時間進程分析，明確了P. p在抗病玉米自交系齊319葉片中的早期侵染動態(tài)。接種后24小時，P. p已完成初始侵染并形成氣孔下囊，但葉片表面無可見癥狀；接種后48小時菌絲擴展并形成吸器，接種后72小時侵染進一步推進但癥狀仍不顯現(xiàn)，直至10天后才出現(xiàn)典型病斑和孢子堆。結合組織學觀察與真菌生物量定量，研究將24和48小時確定為侵染早期的關鍵時間點——此時真菌已建立侵染而寄主防御反應尚未全面啟動，為后續(xù)解析玉米對南方銹病的早期響應機制提供了重要的時間窗口（圖1）。

圖1. 玉米葉片中P. p的侵染過程

2. P. p侵染玉米葉片的細胞類型鑒定

利用單核和空間轉錄組技術，研究團隊構建了P. p侵染24和48小時后玉米葉片的細胞類型圖譜。共獲得13萬余個高質量單細胞核數(shù)據(jù)，經聚類分析鑒定出16個細胞簇，歸并為8種主要細胞類型，包括葉肉細胞、表皮細胞、維管束鞘細胞、保衛(wèi)細胞等（圖2）。通過標記基因篩選和GO富集分析，明確了各細胞類型的功能特征，如葉肉細胞主要參與光合作用和防御相關代謝。結合公共數(shù)據(jù)庫和RNA原位雜交實驗，驗證了關鍵標記基因的特異性表達。該高分辨率單細胞圖譜為后續(xù)解析細胞類型特異性免疫響應提供了可靠的基礎。

圖2. 受P. p侵染的玉米葉片細胞轉錄組圖譜

3. 基于空間轉錄組圖譜的P. p侵染玉米葉片組織可視化分析

進一步利用空間轉錄組技術，實現(xiàn)了對P. p侵染玉米葉片過程中基因表達的空間可視化解析。通過對接種后24和48小時的葉片切片進行測序，共獲得21388個有效空間位點，聚類為7個細胞簇，并成功將其定位到葉片橫切面的具體解剖位置。結合標記基因驗證，明確了5種主要細胞類型：表皮細胞、葉肉細胞、維管束鞘細胞、維管組織細胞和伴胞。進一步鑒定出各細胞類型的特異性標記基因。分析發(fā)現(xiàn)，侵染后24和48小時，表皮細胞和葉肉細胞中細胞類型特異性基因的表達量顯著上升，提示這兩類細胞在玉米應答病原菌侵染過程中發(fā)揮關鍵作用（圖3）。

圖3 受P. p侵染的玉米葉片空間轉錄組圖譜

4. 免疫相關基因的細胞類型特異性差異表達

進一步系統(tǒng)分析了玉米葉片中免疫相關基因的細胞類型特異性表達模式。研究發(fā)現(xiàn)，模式識別受體相關基因（RLPs和RLKs）在侵染后24小時表現(xiàn)出明顯的細胞類型差異：RLP基因（如Zm00001eb170180）主要在葉肉細胞中上調表達，而RLK基因則在表皮細胞和鋪板細胞中顯著激活?？共』蚍矫妫鄶?shù)NL類型基因在侵染后下調，部分CNL類型基因則表現(xiàn)出上調趨勢。進一步分析茉莉酸（JA）和水楊酸（SA）信號通路相關基因發(fā)現(xiàn)，這兩條激素通路的響應不具有明顯的細胞類型特異性，而是在各細胞類型中呈現(xiàn)較為一致的激活模式。值得注意的是，激素通路在侵染后24小時整體被激活，但部分基因（如ZmbHLH116）的表達則延遲至48小時才顯著上調。這些結果表明， 玉米葉片應答侵染時，免疫識別相關基因表現(xiàn)出精細的細胞類型分工，而激素信號通路則呈現(xiàn)時間動態(tài)的協(xié)同調控特征（圖4）。

圖4 免疫相關基因的細胞類型特異性差異表達

5. 共表達網絡分析揭示玉米葉片響應P. p侵染的核心功能模塊

通過共表達網絡分析，揭示了玉米葉片應答P. p侵染過程中的空間協(xié)調防御模式。共鑒定出14個基因共表達模塊，其中3個模塊在侵染后24小時表現(xiàn)出細胞類型特異性的顯著變化：維管束鞘細胞中“綠松石模塊”基因顯著上調，主要參與氧化脅迫響應；葉肉細胞中“黃綠色模塊”被激活，富集于光合作用相關過程；而表皮細胞中“綠色模塊”基因顯著下調，主要涉及細胞壁生物合成。進一步鑒定出各模塊的核心樞紐基因——維管束鞘中的半胱氨酸蛋白酶基因ZmCPP3、葉肉中的光捕獲蛋白基因ZmLHCB7以及表皮中的糖轉運蛋白基因ZmSTP19，它們在侵染早期的表達變化進一步驗證了上述模塊的調控方向。綜合這些結果， 研究提出一個“兩階段防御重編程”模型：1）侵染后24小時，玉米葉片內部細胞（維管束鞘和葉肉）迅速激活脅迫響應和光保護通路，2）同時表皮細胞的結構合成暫時受到抑制。 這種空間上分工明確的調控策略，可能有助于植株在早期將資源集中于關鍵防御部位（圖5）。

圖5 共表達模塊揭示了與玉米葉片受P. p侵染相關的關鍵功能模塊

6. 分化軌跡與細胞注釋揭示防御型葉肉細胞的重要作用

通過擬時序分析，進一步揭示了葉肉細胞在應答P. p侵染過程中的功能分化?；诨虮磉_特征，葉肉細胞被劃分為光合型、前體型、傳遞型、海綿組織型和防御響應型5個功能亞群。擬時序軌跡分析顯示，細胞分化路徑由海綿組織葉肉細胞起始，經防御響應型葉肉細胞，最終到達葉肉傳遞細胞。比較侵染組與對照組發(fā)現(xiàn)，侵染后24小時，兩組細胞分化軌跡出現(xiàn)明顯分離，差異主要集中在海綿組織與防御響應型細胞之間；同時，防御響應型葉肉細胞的比例在24小時顯著上升，至48小時差異減弱。對該亞群的基因功能分析表明，其高表達基因主要參與脅迫應答、脫落酸信號通路和活性氧響應等過程。其中，細胞分裂素誘導蛋白酶基因ZmCIP1在侵染后24小時的葉肉細胞中顯著上調，空間轉錄組數(shù)據(jù)進一步驗證了這一表達特征（圖6）。這些結果表明，防御響應型葉肉細胞是玉米早期免疫的重要組成部分，在病原菌侵染后被迅速招募并執(zhí)行特定的防御任務。

圖6 葉肉細胞響應P. p侵染的分化軌跡

7. 分化細胞間通訊揭示P. p從表皮細胞到葉肉細胞的侵染過程

通過細胞間通訊分析，揭示了玉米葉片應答侵染過程中不同細胞類型之間的協(xié)同配合。分析表明，表皮細胞、葉肉細胞和維管束鞘細胞之間存在廣泛的基因互作網絡（圖7）。聚焦于表皮與葉肉細胞，研究發(fā)現(xiàn)多個配體-受體對在侵染后被激活。例如，表皮細胞中的熱休克蛋白基因ZmHSP90與葉肉細胞中的細胞壁相關激酶基因ZmWAK2存在特異性互作；另一個HSP90家族成員與葉肉細胞中一個未知功能基因的互作對，則僅在侵染后的玉米葉片中檢測到，表現(xiàn)出病原菌誘導的細胞類型特異性（圖7）。進一步整合空間轉錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，表皮細胞中的谷胱甘肽轉移酶基因ZmGST3與葉肉細胞中的Zm00001eb061210這一互作對，在單核和空間兩個數(shù)據(jù)集中均被穩(wěn)定檢出，且兩個基因在侵染后24和48小時均保持高表達水平。這些結果從 分子互作層面證實，表皮細胞與葉肉細胞在病原菌侵染過程中存在活躍的“對話”，這種細胞間的協(xié)同響應是玉米構建有效免疫的重要環(huán)節(jié)（圖7）。

圖 7 細胞間通訊揭示從表皮細胞到葉肉細胞的信號傳導過程

8. 玉米抵御P. p侵染關鍵基因的鑒定

通過整合單核和空間轉錄組數(shù)據(jù)，系統(tǒng)鑒定了玉米應答侵染的關鍵調控基因。差異表達分析顯示，侵染后24小時是轉錄響應最活躍的時期，葉肉細胞、表皮細胞和維管束鞘細胞中大量基因表達發(fā)生變化，而保衛(wèi)細胞中差異基因數(shù)量較少；至48小時，各細胞類型的轉錄響應普遍減弱（圖8）。功能富集分析表明，侵染早期各細胞類型普遍激活蛋白質加工與穩(wěn)定相關通路，而后期主要富集茉莉酸信號和脂質氧化等過程。進一步聚焦于葉肉和表皮細胞，研究在兩個時間點共有的差異表達基因中篩選出5個核心基因。其中，4個基因（ZmEUL、ZmRBG、ZmLOX4、Zm00001eb165310）在侵染后上調表達，而木葡聚糖內轉糖苷酶基因ZmXET1則顯著下調（圖8）。單細胞和空間數(shù)據(jù)均驗證了這些基因的表達變化趨勢。為驗證這些基因的功能，研究采用病毒誘導的基因沉默技術對ZmXET1和ZmRBG進行了表型分析。沉默ZmXET1后，植株接種病原菌后癥狀明顯減輕，真菌生物量減少，細胞損傷程度降低；而沉默ZmRBG則導致病害加重，真菌增殖更旺盛，細胞結構破壞更嚴重。這兩個基因呈現(xiàn)相反的功能 方向：ZmXET1負向調控抗病性，ZmRBG則正向參與防御響應。綜合以上結果，研究不僅從多組學數(shù)據(jù)中挖掘出核心候選基因，還通過功能實驗驗證了它們在玉米抵御過程中的作用，為后續(xù)抗病育種提供了重要靶點。

圖8 參與玉米抵御P. p侵染的關鍵基因

綜上，該研究首次構建了玉米防御南方銹病的高分辨率時空轉錄圖譜，為理解玉米如何在不同細胞層面協(xié)調免疫響應提供了基礎框架。不僅揭示了不同細胞類型在免疫中的“分工合作”，還成功鑒定并驗證了兩個關鍵基因的功能。這一發(fā)現(xiàn)為玉米抗病育種提供了全新的分子靶點，也為未來精準設計抗病作物奠定了重要的理論基礎。

河南省農業(yè)科學院糧食作物研究所/神農種業(yè)實驗室曹言勇研究員、河南農業(yè)大學植物保護學院糧食作物病蟲害檢測與防控創(chuàng)新團隊施艷教授和中國農業(yè)科學院作物科學研究所段燦星研究員為共同通訊作者。河南農業(yè)大學植物保護學院糧食作物病蟲害檢測與防控創(chuàng)新團隊青年教師王瓊瓊博士、河南省農業(yè)科學院糧食作物研究所在站博士后孫新艷副研究員、河南農業(yè)大學在站博士后孫迎超及河南省農業(yè)科學院糧食作物研究所程澤強研究員為論文共同第一作者。河南農業(yè)大學湯繼華教授、李洪連教授，中國農業(yè)科學院作物科學研究所程子祥博士，河南省農業(yè)科學院博士研究生韓勝博，河南農業(yè)大學碩士研究生馮瑩，河南農業(yè)大學生命科學學院青年教師吳曉林副教授、張菁華副教授，以及團隊楊文博博士、朱美琛博士等多名成員也參與了此項工作的研究。本研究得到河南省重點研發(fā)計劃、河南省農業(yè)科學院新興學科專項、北京聯(lián)創(chuàng)種業(yè)科企合作項目、中國農業(yè)科學院農業(yè)科技創(chuàng)新工程、河南省高校創(chuàng)新科研團隊、河南省科學技術協(xié)會青年人才托舉計劃項目及河南省現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系等項目聯(lián)合資助。感謝中國農業(yè)科學院作物科學研究所翁建峰研究員、中國農業(yè)大學周濤教授為本項目提供的指導與幫助。

論文鏈接：

https://doi.org/10.1002/advs.202512295