露兜樹(shù)作為一種兼具藥用價(jià)值的熱帶植物，其葉片與果實(shí)富含酚類、黃酮類、萜類、甾體等多種生物活性成分，已被證實(shí)具有抗炎、抗氧化、抗菌等功效，在人類疾病治療及陸生動(dòng)物養(yǎng)殖中已有應(yīng)用。

已有研究表明，露兜樹(shù)葉提取物可顯著提升鯉魚(yú)的生長(zhǎng)性能與抗病能力（Chi Cheng 等人，2022），其對(duì)水生動(dòng)物病原菌的抑制作用也得到驗(yàn)證（Yosie Andriani 等人，2019），但針對(duì)南美白對(duì)蝦抗副溶血性弧菌的作用及機(jī)制尚未深入闡釋。基于此，本研究通過(guò)室內(nèi)控制實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)探究露兜樹(shù)葉提取物對(duì)南美白對(duì)蝦的免疫增強(qiáng)效果及抗病機(jī)制，旨在為對(duì)蝦綠色養(yǎng)殖技術(shù)的研發(fā)提供理論支撐。

一、實(shí)驗(yàn)材料：

1、實(shí)驗(yàn)對(duì)象：南美白對(duì)蝦幼蝦購(gòu)自馬來(lái)西亞登嘉樓iSHARP Sdn. Bhd.公司，體長(zhǎng)均一（約1cm）、活力良好、無(wú)明顯病害癥狀。

2、提取物制備：采集新鮮露兜樹(shù)葉，洗凈后置于60℃烘箱烘干至恒重，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎過(guò)40目篩，采用70%乙醇溶液回流提取2次，每次2h，合并提取液并減壓濃縮，冷凍干燥后得到露兜樹(shù)葉提取物粉末，實(shí)驗(yàn)時(shí)用無(wú)菌海水配制成0.5、1、2、3、4、5、6g/L共7個(gè)濃度梯度的備用液。

3、病原菌：副溶血性弧菌菌株由實(shí)驗(yàn)室保存，經(jīng)LB液體培養(yǎng)基28℃振蕩培養(yǎng)12h后，用無(wú)菌生理鹽水調(diào)整菌液濃度至1×10? CFU/ml，備用。

二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：

1、蝦苗馴化：實(shí)驗(yàn)前將幼蝦置于溫度28℃、鹽度38‰的循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中馴化2周，持續(xù)充氧保證溶氧量≥6mg/L，養(yǎng)殖密度為2000尾/L，每日分2次投喂鮮活鹵蟲(chóng)幼體，每2天更換1/2養(yǎng)殖水體，維持水質(zhì)穩(wěn)定。每日觀察蝦苗活動(dòng)狀態(tài)，及時(shí)剔除病弱個(gè)體。

2、分組與處理：選取健康幼蝦300尾，隨機(jī)分為8組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10尾蝦。其中7組為實(shí)驗(yàn)組，分別置于上述不同濃度的露兜樹(shù)葉提取物溶液中浸泡24h；1組為對(duì)照組，置于不含提取物的無(wú)菌海水中同等條件處理。

3、病原菌感染：浸泡處理結(jié)束后，所有實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組幼蝦均采用浸浴感染法，置于濃度為1×10? CFU/ml的副溶血性弧菌菌液中感染24h，感染期間維持水溫、鹽度等環(huán)境參數(shù)與馴化期一致。

4、指標(biāo)測(cè)定：感染結(jié)束后，統(tǒng)計(jì)各組幼蝦存活率；采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定蝦體肝胰腺內(nèi)的細(xì)菌負(fù)荷；通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)免疫相關(guān)基因（Hsp70、ProPO、peroxinectin、penaeidin、crustin、transglutaminase）的mRNA表達(dá)水平；取蝦體肝胰組織制作石蠟切片，經(jīng)HE染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

5、重復(fù)性驗(yàn)證：為確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性，整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程重復(fù)2次，數(shù)據(jù)取兩次重復(fù)的平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、露兜樹(shù)葉提取物對(duì)南美白對(duì)蝦存活率的影響：

不同濃度露兜樹(shù)葉提取物處理均能提升南美白對(duì)蝦感染副溶血性弧菌后的存活率，且呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性。當(dāng)提取物濃度為6g/L時(shí)，對(duì)蝦存活率達(dá)到最高，較對(duì)照組提升95%；在中等致死劑量弧菌挑戰(zhàn)試驗(yàn)中，該濃度組存活率較對(duì)照組提升15%，顯著優(yōu)于其他濃度梯度組。而低濃度組（0.5~1g/L）對(duì)蝦存活率與對(duì)照組無(wú)顯著差異，表明露兜樹(shù)葉提取物的抗病效果需達(dá)到一定濃度閾值方可體現(xiàn)。

2、露兜樹(shù)葉提取物對(duì)蝦體細(xì)菌負(fù)荷及免疫基因表達(dá)的影響：

6g/L露兜樹(shù)葉提取物處理組蝦體肝胰腺內(nèi)副溶血性弧菌數(shù)量較對(duì)照組顯著降低，表明提取物可有效抑制病原菌在宿主體內(nèi)的增殖。免疫基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示，6g/L濃度處理可顯著上調(diào)Hsp70、crustin及proPO的mRNA表達(dá)水平，分別較對(duì)照組提升8.5倍、10.4倍和1.5倍；而peroxinectin、penaeidin等其他免疫基因的表達(dá)量無(wú)明顯變化。這一結(jié)果提示，露兜樹(shù)葉提取物主要通過(guò)調(diào)控Hsp70介導(dǎo)的免疫通路發(fā)揮作用，Hsp70作為關(guān)鍵中介因子，可激活酚氧化酶原系統(tǒng)，進(jìn)而增強(qiáng)蝦體的抗菌免疫應(yīng)答。

3、露兜樹(shù)葉提取物對(duì)蝦體肝胰管組織形態(tài)的影響：

組織學(xué)觀察結(jié)果顯示，經(jīng)6g/L露兜樹(shù)葉提取物處理后再感染副溶血性弧菌的對(duì)蝦，其肝胰管結(jié)構(gòu)完整，膽管壁光滑，上皮細(xì)胞（包括Blassenzelen細(xì)胞、Fibrillendene細(xì)胞和Restzellen細(xì)胞）排列整齊，無(wú)明顯退化或損傷現(xiàn)象。而對(duì)照組對(duì)蝦（僅感染弧菌未處理提取物）的肝胰管出現(xiàn)明顯病理變化，膽管上皮細(xì)胞大量脫落，細(xì)胞數(shù)量顯著減少，肝胰管結(jié)構(gòu)完整性遭到嚴(yán)重破壞。這一結(jié)果證實(shí)，露兜樹(shù)葉提取物可有效保護(hù)對(duì)蝦肝胰組織免受病原菌侵害，其作用機(jī)制與提取物中含有的咖啡?？鼘幩?、維生素、肉桂酸酯等抗氧化成分密切相關(guān)。

四、討論：

本研究結(jié)果明確了露兜樹(shù)葉提取物對(duì)南美白對(duì)蝦抗副溶血性弧菌的保護(hù)作用，其核心機(jī)制可歸納為兩個(gè)方面：一是提取物中的酚類、黃酮類等抗菌成分可直接抑制副溶血性弧菌的增殖，降低病原菌在蝦體內(nèi)的定植能力，從而減少菌體對(duì)組織的損傷；二是通過(guò)上調(diào)Hsp70、crustin等免疫相關(guān)基因的表達(dá)，激活蝦體固有免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)病原菌的清除能力。

在濃度梯度實(shí)驗(yàn)中，6g/L為最優(yōu)處理濃度，這一結(jié)果為實(shí)際養(yǎng)殖應(yīng)用提供了精準(zhǔn)的劑量參考。與傳統(tǒng)抗生素相比，露兜樹(shù)葉提取物不僅無(wú)耐藥性誘導(dǎo)風(fēng)險(xiǎn)，還能改善養(yǎng)殖環(huán)境，符合水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)綠色發(fā)展的需求。此外，露兜樹(shù)作為熱帶地區(qū)廣泛分布的植物，資源豐富、提取成本較低，具備大規(guī)模推廣應(yīng)用的潛力。

五、結(jié)論：

本研究證實(shí)，6g/L露兜樹(shù)葉提取物浸泡南美白對(duì)蝦幼蝦24h，可通過(guò)抑制副溶血性弧菌增殖、上調(diào)免疫相關(guān)基因表達(dá)、保護(hù)肝胰管組織結(jié)構(gòu)完整性，顯著提升對(duì)蝦的抗病能力。該技術(shù)為對(duì)蝦養(yǎng)殖病害的綠色防控提供了新途徑，同時(shí)也拓展了露兜樹(shù)藥用資源的應(yīng)用領(lǐng)域。未來(lái)可基于本研究結(jié)果，開(kāi)發(fā)針對(duì)性的對(duì)蝦免疫增強(qiáng)劑，推動(dòng)水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展。