聽覺刺激引發(fā)反應(yīng)通常涉及到使用特定的聲音或噪聲作為刺激，以引發(fā)實(shí)驗(yàn)對象（如人類或動物）的特定反應(yīng)。這些反應(yīng)可以是行為上的，也可以是生理上的，例如腦電波的變化、肌肉的收縮或是身體動作等。

動物固定與適應(yīng)：將小鼠妥善固定在實(shí)驗(yàn)裝置上，使其頭部保持穩(wěn)定，便于進(jìn)行鈣成像監(jiān)測。在正式給予聽覺刺激前，先讓小鼠在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中適應(yīng)一段時間，使其狀態(tài)穩(wěn)定。

給予聽覺刺激：按照設(shè)定好的參數(shù)，通過音響設(shè)備向?qū)嶒?yàn)箱內(nèi)播放相應(yīng)的聲音刺激，同時通過在體雙光子鈣成像系統(tǒng)實(shí)時監(jiān)測小鼠初級體感皮層桶狀區(qū)神經(jīng)元的鈣信號變化，記錄神經(jīng)元的活動情況，包括神經(jīng)元的放電頻率、活動強(qiáng)度等指標(biāo) 。

多次重復(fù)刺激：為了確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和穩(wěn)定性，通常會對同一小鼠進(jìn)行多次聽覺刺激實(shí)驗(yàn)，每次刺激之間保持一定的時間間隔，讓小鼠有足夠的時間恢復(fù)，同時在不同的小鼠身上重復(fù)該實(shí)驗(yàn)過程，以獲取更具普遍性的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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刺激配對范式具體步驟：

小鼠在雙光子顯微鏡下固定頭部，并呈現(xiàn)包括觸覺刺激、聽覺刺激或聯(lián)合視聽刺激的試驗(yàn)。觸覺刺激由步進(jìn)電機(jī)通過移動桿穿過胡須，步進(jìn)電機(jī)旋轉(zhuǎn)一個完整的360度。電機(jī)以每秒1800度的角速度偏轉(zhuǎn)胡須。聽覺刺激包括300毫秒的帶限噪聲爆發(fā)，頻率范圍有兩種：較低頻率范圍8.5-10.5 kHz（N1）和較高頻率范圍16.5-18.5 kHz（N2）。聽覺刺激由數(shù)據(jù)采集板隨機(jī)生成，輸出采樣率為100kHz，并通過一個0.25W、8U揚(yáng)聲器播放，揚(yáng)聲器位于距離小鼠耳朵4.5厘米的位置。使用SilentStepStick TMC 2100步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動器控制步進(jìn)電機(jī)，以最小化聲噪。聯(lián)合視聽刺激包括先是一個聽覺刺激，然后大約30毫秒后是一個觸覺刺激接觸胡須。在一些額外的試驗(yàn)中，既不呈現(xiàn)聽覺刺激也不呈現(xiàn)觸覺刺激。所有刺激都由Arduino微控制器觸發(fā)，它向步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動器和音頻信號發(fā)生器發(fā)出共同的TTL信號，以確保觸覺和聽覺刺激之間的一致性延遲。在沒有胡須刺激的試驗(yàn)中（僅聲音和無刺激試驗(yàn)），桿從小鼠臉部移開。總共呈現(xiàn)了6種不同的刺激條件：單獨(dú)的胡須刺激（W）、單獨(dú)的噪聲1（N1）、單獨(dú)的噪聲2（N2）、胡須刺激加聲音1（W+N1）、胡須刺激加聲音2（W+N2）和無刺激（NS）。

小鼠在成像前一周適應(yīng)頭部固定。在適應(yīng)期間，掃描儀在目標(biāo)就位的情況下運(yùn)行，以使小鼠適應(yīng)雙光子設(shè)置的環(huán)境噪音。然后，在配對開始的前一天，小鼠在預(yù)配對探針測試中接受所有刺激條件的隨機(jī)交錯試驗(yàn)（每個條件100次試驗(yàn)）。在配對階段，未獎勵范式中的小鼠接受了連續(xù)三天的配對試驗(yàn)，每個測試包括800次隨機(jī)交錯的W+N1和N2試驗(yàn)（每個條件400次試驗(yàn)）。配對后，小鼠被呈現(xiàn)額外的隨機(jī)交錯試驗(yàn)的后配對探針測試。

在獎勵范式中，小鼠在配對前一周被限制飲水。除了適應(yīng)頭部固定外，通過每次小鼠舔舐時從舔口提供水來觀察行為。在所有條件的未獎勵刺激的初始預(yù)配對之后，小鼠每天接受包括隨機(jī)交錯的W+N1和W+N2試驗(yàn)的配對（每個條件400次試驗(yàn)）。使用連接到舔口的電容觸摸傳感器測量舔舐，配對期間的預(yù)期舔舐被量化為在追蹤間隔期間至少發(fā)生一次舔舐的概率。小鼠每天至少接受兩周的配對。如果小鼠在兩周結(jié)束時連續(xù)兩次測試的預(yù)期舔舐概率至少為0.7，則停止配對，并給予包括所有條件的隨機(jī)試驗(yàn)的后配對探針測試，不給予獎勵。如果小鼠在兩周結(jié)束時過去兩天的預(yù)期舔舐概率低于0.7，則再給予一周的配對測試，之后給予后配對探針測試。

聽覺腦干反應(yīng)記錄：

為了驗(yàn)證兩種聽覺刺激在耳蝸和腦干水平上引起相似的反應(yīng)，配對完成后對每只小鼠進(jìn)行聽覺腦干反應(yīng)記錄。麻醉小鼠，體溫維持在37.0°C。小鼠顱骨被削薄，以便將銀線電極直接植入大腦。參考電極插入左耳基部，尾巴接地。信號被一個20倍增益的電池供電前置放大器放大，然后通過一個Lynx放大器放大，增益設(shè)置為3004倍，低頻和高頻截止頻率分別為300 Hz和3000 Hz。每個刺激被呈現(xiàn)1000次，每個條件的數(shù)據(jù)在試驗(yàn)中平均。

記錄小鼠的行為，特別是胡須的運(yùn)動。在聽覺刺激過程中，持續(xù)記錄小鼠初級體感皮層桶狀區(qū)神經(jīng)元的鈣成像數(shù)據(jù)，以及與聽覺刺激相關(guān)的各種參數(shù)信息，如聲音類型、強(qiáng)度、頻率、刺激時間等。

文獻(xiàn)引用：

• Kato DD, Bruno RM. Stability of cross-sensory input to primary somatosensory cortex across experience. bioRxiv [Preprint]. 2024 Aug 9:2024.08.07.607026.

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