摘要：單克隆抗體（mAb）這類生物藥已成為治療多種疾病的 “主力軍”，但它們依賴哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)，容易遭遇內(nèi)源性或外源性病毒污染，給患者安全帶來隱患。病毒清除是生物制藥下游加工（DSP）的核心環(huán)節(jié)，通過色譜法、化學(xué)滅活、病毒過濾等多重技術(shù)組合，構(gòu)建起層層遞進(jìn)的安全防線。本文將用通俗的語言拆解這些抗病毒技術(shù)，帶你了解生物制藥如何通過科學(xué)設(shè)計，讓每一支藥劑都遠(yuǎn)離病毒威脅，同時揭秘這項(xiàng)技術(shù)的最新進(jìn)展與未來方向。

一、為什么病毒清除是生物制藥的 “必答題”？

生物藥和傳統(tǒng)化學(xué)藥不一樣，它是 “活細(xì)胞造出來的藥”。像我們常說的單抗藥，大多是通過培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞來生產(chǎn)的 —— 這些細(xì)胞雖然能高效合成藥物，但也可能攜帶自身的病毒，或者在生產(chǎn)過程中不小心引入外界病毒（也就是“ adventitious 病毒”）。

這些病毒一旦混入藥物，后果不堪設(shè)想。比如細(xì)小病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等，哪怕只有微量存在，都可能讓用藥患者感染。因此，病毒安全是生物制藥的 “生命線”，而下游加工（DSP）階段的病毒清除，就是守住這條生命線的關(guān)鍵步驟。

根據(jù) 2024 年生效的 ICH-Q5A (R2) 指南，所有用動物或人類細(xì)胞生產(chǎn)的生物藥，都必須通過嚴(yán)格的病毒清除驗(yàn)證，確保每一步工藝都能有效降低病毒載量。而衡量清除效果的核心指標(biāo)，就是LRV（對數(shù)降低值）—— 比如 LRV≥4，就意味著病毒量減少了 1 萬倍以上，足以保障用藥安全。

二、病毒清除的 “主力軍”：色譜法的多重妙用

色譜法是生物制藥純化的核心技術(shù)，既能提純藥物有效成分，還能順帶 “篩掉” 病毒，堪稱病毒清除的 “多面手”。它就像一個精密的 “分揀系統(tǒng)”，根據(jù)病毒和藥物分子的物理化學(xué)差異，把病毒從藥物中分離出來。

1. Protein A 親和色譜：藥物提純 + 病毒初篩

Protein A 親和色譜是單抗藥提純的 “黃金標(biāo)準(zhǔn)”，它能精準(zhǔn)識別并結(jié)合單抗的 Fc 區(qū)域，把藥物分子從復(fù)雜的細(xì)胞培養(yǎng)液中 “抓” 出來。在這個過程中，大部分病毒因?yàn)闊o法結(jié)合 Protein A，會直接隨廢液排出，通常能實(shí)現(xiàn) 1-4 個 LRV 的清除效果。

不過它的清除效果不夠穩(wěn)定 —— 有些病毒會 “黏上” 單抗分子或色譜樹脂，跟著藥物一起被洗脫下來。這時候科學(xué)家會在洗滌液中加入精氨酸、尿素等添加劑，破壞病毒與藥物的相互作用，進(jìn)一步提升清除效率。

2. 離子交換色譜：精準(zhǔn) “捕獲” 帶電病毒

離子交換色譜（IEX）分為陽離子交換（CEX）和陰離子交換（AEX）兩種，核心原理是利用病毒和樹脂的電荷差異來分離。大部分病毒在中性 pH 環(huán)境下帶負(fù)電，所以AEX（陰離子交換色譜）用得更廣泛，常以 “流穿模式” 運(yùn)作 —— 藥物分子不結(jié)合樹脂直接穿過，病毒則被帶正電的樹脂牢牢吸附。

AEX 對包膜病毒（如 X-MuLV）的清除效果特別好，LRV 能達(dá)到 5-6，但對細(xì)小病毒（如 MVM）的效果不穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)，病毒的表面電荷分布比整體等電點(diǎn)（pI）更影響結(jié)合效果，這也讓科學(xué)家能通過優(yōu)化 pH 和離子強(qiáng)度，讓清除效果更穩(wěn)定（圖 1）。

3. 其他色譜技術(shù)：各顯神通

疏水相互作用色譜（HIC）：利用病毒表面的疏水性差異分離，包膜病毒因?yàn)楸砻嬗兄|(zhì)膜，疏水性更強(qiáng)，更容易被 HIC 樹脂吸附，清除效果更優(yōu)。

混合模式色譜（MMC）：同時利用電荷、疏水、氫鍵等多種相互作用，適用范圍更廣，在 pH 4.9-7.5、電導(dǎo)率 5.1-26 mS/cm 的寬范圍內(nèi)都能穩(wěn)定清除病毒，LRV 可達(dá) 5 以上。

三、病毒清除的 “殺手锏”：專門的滅活與過濾技術(shù)

如果說色譜法是 “順帶” 清除病毒，那化學(xué)滅活和病毒過濾就是針對病毒的 “精準(zhǔn)打擊”，是構(gòu)建病毒安全防線的核心步驟。

1. 化學(xué)滅活：給病毒 “致命一擊”

化學(xué)滅活主要針對包膜病毒，通過破壞病毒的脂質(zhì)包膜讓其失去感染性，常用兩種方式：

低 pH 滅活：這是最常用的方法，把藥物溶液的 pH 調(diào)到 3.5-3.8，孵育 30-60 分鐘，就能讓大部分包膜病毒的 LRV≥5.3。為了防止藥物在酸性條件下聚集，會加入精氨酸、極端微生物代謝物（extremolytes）等穩(wěn)定劑。

溶劑/去污劑（S/D）處理：用 TNBP（磷酸三丁酯）搭配去污劑，1 分鐘內(nèi)就能實(shí)現(xiàn) 4-6 個 LRV 的滅活效果。不過傳統(tǒng)去污劑 Triton X-100 因環(huán)保問題被限制使用，現(xiàn)在正被 OG、LDAO 等更安全的替代品取代。

但這種方法對無包膜病毒（如細(xì)小病毒）效果很差，需要其他技術(shù)配合。

2. 病毒過濾：最后的 “物理屏障”

病毒過濾是病毒清除的 “最后一道防線”，靠的是 “尺寸篩選”—— 用孔徑極細(xì)的膜，讓藥物分子（約 12 nm）通過，而病毒（最小約 18 nm）被牢牢攔住。

這種方法對所有病毒都有效，尤其是難對付的細(xì)小病毒，能輕松實(shí)現(xiàn) > 4 個 LRV 的清除。常用的過濾膜有 PVDF、PES、再生纖維素等材質(zhì)，分為 “直流過濾（DFF）” 和 “切向流過濾（TFF）” 兩種模式（表 2）。

不過過濾過程中要注意 “膜污染”—— 如果膜的孔徑被雜質(zhì)堵住，可能會讓小病毒 “漏網(wǎng)”。因此，控制過濾流量、提前處理樣品，是保證過濾效果的關(guān)鍵。

3. 新興物理滅活技術(shù)：紫外線與臭氧

除了傳統(tǒng)方法，科學(xué)家還在探索更溫和的物理滅活技術(shù)：

UV-C 照射：用 254 nm 的紫外線破壞病毒核酸，不影響藥物結(jié)構(gòu)，對無包膜病毒的 LRV 可達(dá) 4-6，適合作為額外的安全保障。

臭氧處理：利用臭氧的強(qiáng)氧化性破壞病毒包膜和衣殼蛋白，無化學(xué)殘留，目前還在研發(fā)階段。

四、病毒怎么 “算” 被清除了？檢測技術(shù)是關(guān)鍵

要證明病毒被有效清除，離不開精準(zhǔn)的檢測技術(shù)。目前主要用 “infectivity 檢測 + 分子檢測” 的組合方式，確保結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

1.感染率檢測：看病毒 “還能不能活”

這類方法直接檢測病毒的感染能力，是驗(yàn)證病毒清除效果的 “金標(biāo)準(zhǔn)”：

TCID??測定：將病毒樣品稀釋后感染細(xì)胞，觀察細(xì)胞病變（CPE），計算能讓 50% 細(xì)胞感染的病毒濃度（圖 2A）。

空斑測定：讓病毒在細(xì)胞培養(yǎng)皿上形成可見的 “空斑”，通過計數(shù)空斑數(shù)量確定活病毒濃度（圖 2B）。

但這類方法耗時較長，通常需要幾天到幾周。

2. 分子檢測：看病毒 “有沒有殘留”

qPCR（實(shí)時定量 PCR）：檢測病毒的核酸，靈敏度極高，幾小時就能出結(jié)果，能快速判斷病毒是否殘留（圖 2C）。但它會同時檢測活病毒和死病毒，不能單獨(dú)作為感染性判斷依據(jù)。

NGS（下一代測序）：能同時檢測所有病毒的核酸，不管是已知病毒還是未知病毒都能發(fā)現(xiàn)，是病毒 surveillance 的 “神器”（圖 2D）。

圖 1 單抗純化下游加工（DSP）中病毒清除的主要步驟示意圖

圖 2 病毒檢測的四種主要方法流程圖

表 1 病毒清除研究中常用的模型病毒

表 2 病毒去除研究中常用的過濾膜

五、病毒清除技術(shù)的 “進(jìn)化史”：從批次到連續(xù)，從樹脂到膜

隨著生物制藥技術(shù)的發(fā)展，病毒清除工藝也在不斷升級，變得更高效、更穩(wěn)定、更環(huán)保。

1.連續(xù)加工：讓病毒清除 “不中斷”

傳統(tǒng)的批次工藝是 “一步一?！保?strong>連續(xù)下游加工（CDSP）能讓捕獲、滅活、過濾等步驟無縫銜接。研究證明，連續(xù)工藝的病毒清除效果和批次工藝一樣好 —— 比如連續(xù) Protein A 捕獲、在線低 pH 滅活、長時間病毒過濾，都能實(shí)現(xiàn)≥4 個 LRV 的清除效果，還能提高生產(chǎn)效率、降低成本。

2. 膜色譜：比傳統(tǒng)樹脂更 “能打”

傳統(tǒng)的色譜柱用的是樹脂顆粒，而膜色譜用的是多孔膜，病毒能更輕松地接觸到膜上的功能基團(tuán)， binding capacity 比樹脂高 5-10 倍。而且膜色譜能承受更高的流速，處理效率是樹脂柱的 3 倍以上，還能在高離子強(qiáng)度下保持穩(wěn)定的病毒清除效果，特別適合大規(guī)模生產(chǎn)。

3. 活性炭過濾：低成本的 “意外之喜”

誰能想到，平時用來凈水的活性炭（AC），在病毒清除中也能發(fā)揮大作用。它通過疏水、離子等多種作用吸附病毒，單次過濾就能實(shí)現(xiàn) 3-5.8 個 LRV 的清除效果，還能同時去除宿主細(xì)胞蛋白、DNA 等雜質(zhì)。

圖 3 采用活性炭（AC）過濾器的無柱單通道過濾法實(shí)現(xiàn)的病毒清除效果

注：柱狀圖展示了三種單克隆抗體制劑（mAb A、mAb B、mAb C）中，AC 過濾器對 MVM 和 X-MuLV 病毒的 LRV 值，包含未處理的加標(biāo)對照、過濾前加標(biāo)樣品和過濾后產(chǎn)物池的對比數(shù)據(jù)。

把它和 AEX 膜搭配使用，既能降低成本，又能提升清除效果 ——AC 先吸附大部分病毒和雜質(zhì)，避免 AEX 膜被污染，后續(xù) AEX 膜再捕獲殘留病毒，形成 “雙重保障”。這種組合工藝不僅效果穩(wěn)定，還無需昂貴的 Protein A 樹脂，是下一代生物制藥工藝的潛力選手。

六、未來展望：更安全、更高效的病毒清除之路

生物制藥的病毒清除技術(shù)，正朝著 “更精準(zhǔn)、更靈活、更環(huán)?！?的方向發(fā)展。未來，我們可能會看到：

定制化的病毒清除方案：根據(jù)不同藥物的特性，設(shè)計專屬的色譜 + 滅活 + 過濾組合，讓清除效果更優(yōu)；

更多綠色技術(shù)的應(yīng)用：比如用可降解的去污劑、更環(huán)保的過濾膜，減少生產(chǎn)過程中的環(huán)境負(fù)擔(dān)；

AI 輔助工藝設(shè)計：通過計算機(jī)模擬，快速優(yōu)化 pH、離子強(qiáng)度等參數(shù)，縮短工藝開發(fā)時間。

說到底，病毒清除技術(shù)的每一次進(jìn)步，都是為了讓生物藥更安全、更可及。從細(xì)胞培養(yǎng)到最終藥劑，這層層遞進(jìn)的抗病毒防線，守護(hù)的是每一位患者的希望。而我們對這項(xiàng)技術(shù)的不斷探索，也正是生物制藥行業(yè) “以患者為中心” 的最好體現(xiàn)。

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