從頭合成一個(gè)完整的單細(xì)胞生命，是當(dāng)代生命科學(xué)面臨的一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)。目前，科學(xué)家已在構(gòu)建基礎(chǔ)生命功能模塊方面取得進(jìn)展，例如在人工磷脂囊泡中實(shí)現(xiàn)DNA復(fù)制，以及利用前體分子合成磷脂以促進(jìn)囊泡表面積的增長。然而，僅將這些功能模塊進(jìn)行簡單組裝，尚難以實(shí)現(xiàn)生命活動(dòng)的有序運(yùn)行。當(dāng)前面臨的主要瓶頸之一，在于對這些模塊之間協(xié)同工作的基本原理仍缺乏系統(tǒng)認(rèn)識，這也限制了人工合成細(xì)胞形成生長、復(fù)制與分裂這一完整生命循環(huán)的能力。

針對這一關(guān)鍵問題，中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所劉陳立研究員團(tuán)隊(duì)長期致力于探究天然細(xì)胞中DNA復(fù)制、生物量積累和細(xì)胞分裂等核心功能模塊的協(xié)同機(jī)制。在前期研究中，團(tuán)隊(duì)以大腸桿菌為模型，利用定量合成生物學(xué)方法，揭示了細(xì)胞生長速率與細(xì)胞尺寸之間的數(shù)學(xué)規(guī)律，并發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌通過“分裂許可物”來協(xié)同生長和分裂的新機(jī)制（Nature Microbiology 2020）。

在此基礎(chǔ)上，團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步發(fā)揮定量合成生物學(xué)研究范式的優(yōu)勢，設(shè)計(jì)合成了一套能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測DNA復(fù)制關(guān)鍵啟動(dòng)蛋白DnaA活性的“分子探測器”，首次在活細(xì)胞中觀測到DnaA活性振蕩的峰值始終精準(zhǔn)出現(xiàn)在DNA復(fù)制起始時(shí)刻，從而在實(shí)驗(yàn)上直接驗(yàn)證了經(jīng)典理論中“DnaA活性決定DNA復(fù)制起始時(shí)機(jī)”的核心預(yù)測。此外，為解釋“DnaA表達(dá)停止后DNA仍可進(jìn)行多輪復(fù)制”這一經(jīng)典理論未能充分闡釋的現(xiàn)象，團(tuán)隊(duì)通過結(jié)合數(shù)學(xué)建模與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，創(chuàng)新性地提出了DnaA活性調(diào)控的“擠出”機(jī)制。該機(jī)制表明，可能存在某種調(diào)控蛋白能夠?qū)⒔Y(jié)合在DNA上的DnaA“擠出”，使其重新獲得啟動(dòng)DNA復(fù)制的活性。進(jìn)一步研究提示，H-NS蛋白很可能在其中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。

該工作不僅直接證實(shí)了DnaA活性的周期性振蕩是觸發(fā)DNA復(fù)制的核心信號，還系統(tǒng)揭示了細(xì)菌通過“擠出”機(jī)制實(shí)現(xiàn)對DNA復(fù)制過程的精確時(shí)序調(diào)控，為理解生命體中DNA合成與生物量增長之間的協(xié)同機(jī)制提供了嶄新的理論視角。相關(guān)成果近日以Extrusion-modulatedDnaAactivity oscillations coordinate DNA replication with biomass growth為題，正式被eLife雜志收錄。

圖1. 《eLife》雜志上刊發(fā)的文章截圖

DNA復(fù)制起始是細(xì)菌細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。學(xué)界普遍認(rèn)為，大腸桿菌通過精確控制DNA復(fù)制的起始時(shí)機(jī)，實(shí)現(xiàn)DNA的線性合成與生物量指數(shù)增長之間的協(xié)調(diào)匹配。經(jīng)典理論指出，關(guān)鍵啟動(dòng)蛋白DnaA的持續(xù)合成可以反應(yīng)生物量的積累，其與DNA的相互作用則能感知DNA合成狀態(tài)，進(jìn)而通過活性變化決定復(fù)制起始時(shí)機(jī)。然而，長期以來，領(lǐng)域內(nèi)并未直接觀測到DnaA活性變化與DNA復(fù)制起始之間的動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)，且在DnaA合成被阻斷之后，DNA復(fù)制仍可啟動(dòng)，這些現(xiàn)象無法用現(xiàn)有理論完整解釋，表明人們對細(xì)菌生長與DNA復(fù)制之間的協(xié)同機(jī)制認(rèn)識尚不全面。

合成DnaA活性“探測器”：定量其振蕩與DNA復(fù)制起始的關(guān)系

為直接觀測DnaA蛋白活性的細(xì)胞周期性振蕩，劉陳立團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了DnaA活性可定量調(diào)節(jié)的平臺菌株，設(shè)計(jì)并合成了一系列可響應(yīng)DnaA活性的合成啟動(dòng)子。通過系統(tǒng)定量這些啟動(dòng)子對DnaA活性變化的響應(yīng)特性，團(tuán)隊(duì)篩選出了對DnaA活性高度敏感且響應(yīng)特異的啟動(dòng)子Psyn66。隨后，借助mRNA熒光原位雜交技術(shù)，并以不響應(yīng)DnaA活性的組成型啟動(dòng)子Pcon作為參照，解析出Psyn66報(bào)告的DnaA活性的細(xì)胞周期變化規(guī)律。定量分析表明：無論生長速率如何改變或基因表達(dá)受到何種干擾，DnaA活性均隨細(xì)胞大小呈現(xiàn)顯著振蕩，該振蕩與dnaA基因的轉(zhuǎn)錄無關(guān)，且其峰值始終精準(zhǔn)出現(xiàn)在DNA復(fù)制起始的時(shí)刻。這一結(jié)果在實(shí)驗(yàn)上直接驗(yàn)證了經(jīng)典理論關(guān)于“細(xì)菌DnaA活性決定DNA復(fù)制起始時(shí)機(jī)”的核心預(yù)測。

圖2. 合成DnaA活性“探測器”，定量其周期性振蕩與DNA復(fù)制起始的關(guān)系

DnaA活性調(diào)控“擠出”機(jī)制的提出及例證

在驗(yàn)證經(jīng)典理論的基礎(chǔ)上，團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步探究了“DnaA表達(dá)停止后DNA仍可進(jìn)行多輪復(fù)制”這一經(jīng)典理論未能解釋的現(xiàn)象，并提出了一種新的DnaA活性調(diào)控機(jī)制——“擠出模型”（extrusion model）。該模型推測，除了已知的調(diào)控途徑外，細(xì)胞內(nèi)可能還存在一種可與DNA結(jié)合的“擠出因子”，它能夠通過構(gòu)象變化或競爭性結(jié)合，促使結(jié)合在DNA上的DnaA蛋白釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而使DnaA活性在其合成停止后仍可維持一段時(shí)間的上升，以啟動(dòng)后續(xù)幾輪DNA復(fù)制。

圖3. DnaA活性調(diào)控“擠出”機(jī)制的提出及例證

通過系統(tǒng)篩選細(xì)胞內(nèi)可與擬核結(jié)合的蛋白質(zhì)，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)高豐度DNA結(jié)合蛋白H-NS具備“擠出因子”的潛在特征，隨后合成并引入相關(guān)基因線路，穩(wěn)定或瞬時(shí)提升H-NS的表達(dá)水平，結(jié)果觀察到DnaA活性迅速增強(qiáng)，且DNA復(fù)制起始時(shí)機(jī)相應(yīng)提前。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為H-NS可能作為“擠出因子”參與調(diào)控DnaA活性提供了直接證據(jù)，進(jìn)一步支持了“擠出模型”的合理性。

該研究秉承“造物致知”的研究理念，通過對生命系統(tǒng)進(jìn)行合成重構(gòu)與定量表征，并結(jié)合理論建模與仿真分析，揭示了協(xié)調(diào)細(xì)胞生長和DNA合成的新機(jī)制：DnaA活性的“擠出式”調(diào)控。這一發(fā)現(xiàn)不僅深化了人們對細(xì)菌細(xì)胞周期調(diào)控的理解，也為人工合成生命功能模塊的協(xié)同調(diào)控提供了新的設(shè)計(jì)思路。未來，在組裝具有復(fù)雜功能的人工生命系統(tǒng)時(shí)，或許可以借鑒此類天然調(diào)控機(jī)制，使各個(gè)功能模塊像細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的高度協(xié)同網(wǎng)絡(luò)一樣，實(shí)現(xiàn)有序、高效且穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)運(yùn)轉(zhuǎn)。

中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成所劉陳立研究員為該文章的通訊作者，助理研究員李登進(jìn)、副研究員鄭海和白陽為該文章的共同第一作者。

原文鏈接：https://elifesciences.org/articles/107214

制版人：十一

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