麥盧卡蜂蜜是由蜜蜂采集生長于新西蘭和澳大利亞的麥盧卡樹（Leptospermum scoparium）的花蜜制成，其含有甲基乙二醛（MGO）、多酚類化合物和黃酮類物質(zhì)等活性成分，這些成分被認(rèn)為是其強效抗炎作用的主要貢獻者。研究表明，麥盧卡蜂蜜通過調(diào)控炎癥信號通路，不僅可以抑制促炎因子的釋放，還能夠減輕氧化應(yīng)激對細(xì)胞的損傷。

炎癥是一種復(fù)雜的生理免疫反應(yīng)，當(dāng)炎癥反應(yīng)過度或調(diào)控失衡時，常導(dǎo)致組織損傷，進而誘發(fā)多種慢性炎癥性疾病。脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的重要成分，是研究體外炎癥模型中廣泛應(yīng)用的經(jīng)典誘導(dǎo)劑。核因子κB（NF-κB）作為炎癥信號通路的核心轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)控多種與炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答和細(xì)胞生存相關(guān)的基因中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

中國計量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院周小玲、趙微、張雅芬*等通過LPS誘導(dǎo)構(gòu)建Caco-2和HepG2細(xì)胞炎癥損傷模型，分別模擬腸道屏障和肝臟炎癥環(huán)境，進一步通過細(xì)胞活性檢測和促炎因子的表達(dá)系統(tǒng)評估麥盧卡蜂蜜的抗炎作用及其可能機制，旨在明確麥盧卡蜂蜜在炎癥調(diào)控中的作用，為其在腸道和肝臟炎癥性疾病中的應(yīng)用提供理論支持，并為炎癥相關(guān)疾病的治療策略提供新的思路和方向。

1 細(xì)胞炎癥模型的建立

采用CCK-8法檢測LPS對細(xì)胞生存率的影響，初步得選合適的LPS誘導(dǎo)質(zhì)量濃度，結(jié)果如圖1所示，在1、6、12 h內(nèi)，LPS質(zhì)量濃度在2.00 μg/mL及以上時，HepG2細(xì)胞活性顯著下降（P＜0.05），LPS質(zhì)量濃度為4.00 μg/mL時，Caco-2細(xì)胞活性顯著下降（P＜0.05）。

進一步通過顯微鏡觀察不同質(zhì)量濃度（0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 μg/mL）LPS處理對HepG2和Caco-2細(xì)胞形態(tài)的影響。如圖2所示，正常的HepG2呈現(xiàn)典型的上皮樣形態(tài)，胞體圓潤。0.25、0.50 μg/mL LPS處理HepG2在1、6、12 h無明顯變化，細(xì)胞間連接略微松散，但整體細(xì)胞層保持較為完整。1.00、2.00、4.00 μg/mL LPS處理組形態(tài)發(fā)生了顯著變化，細(xì)胞黏連，變得更加擴展，當(dāng)處理6 h和12 h時，2.00、4.00 μg/mL細(xì)胞損傷更加嚴(yán)重，大量細(xì)胞死亡。而正常生長狀態(tài)下Caco-2細(xì)胞呈片狀分布并形成明顯的紋狀細(xì)胞緊密連接結(jié)構(gòu)（圖3）。經(jīng)0.25、0.50、1.00 μg/mL LPS處理后，1、6 h和12 h內(nèi)，Caco-2細(xì)胞的細(xì)胞間連接保持緊密，未見顯著形態(tài)變化。在2.00、4.00 μg/mL LPS處理細(xì)胞時，細(xì)胞緊密連接結(jié)構(gòu)消失，4.00 μg/mL出現(xiàn)大量死細(xì)胞。在2.00 μg/mL LPS處理下，細(xì)胞出現(xiàn)炎癥損傷并伴隨紋狀緊密連接的模糊，細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。

最后，通過實時熒光定量PCR檢測HepG2和Caco-2細(xì)胞在LPS誘導(dǎo)后不同時間點（1、6、12 h）IL-1β和IL-6基因的表達(dá)量。如圖4所示，LPS處理組中，IL-1β和IL-6的表達(dá)水平均顯著高于對照組（P＜0.05），表明LPS處理成功誘導(dǎo)了促炎因子的表達(dá)。HepG2和Caco-2中IL-1β基因的表達(dá)水平在LPS誘導(dǎo)1 h后達(dá)到最高（P＜0.05）。IL-6基因的表達(dá)峰值則存在一定的細(xì)胞差異：在HepG2細(xì)胞中，IL-6基因的表達(dá)在1 h時達(dá)到最高水平，隨著時間的延長，其基因表達(dá)量顯著下降（P＜0.05）；而在Caco-2細(xì)胞中，IL-6基因的表達(dá)在6 h時達(dá)到最高水平，隨后在12 h時出現(xiàn)回落。

結(jié)合分析細(xì)胞活性、細(xì)胞形態(tài)特征和炎癥因子的表達(dá)情況，結(jié)果表明，1.00 μg/mL的LPS誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)了炎癥反應(yīng)特征，但是未出現(xiàn)細(xì)胞壞死，細(xì)胞存活率沒有顯著性降低；因此，對于HepG2細(xì)胞選擇1.00 μg/mL的LPS誘導(dǎo)炎癥損傷；對于Caco-2細(xì)胞，2.00 μg/mL LPS可誘導(dǎo)典型的炎癥反應(yīng)特征，同樣未觀察到細(xì)胞凋亡或壞死，細(xì)胞存活率也未顯著下降，因此Caco-2細(xì)胞選擇2.00 μg/mL的LPS誘導(dǎo)炎癥損傷。進一步通過炎癥因子的誘導(dǎo)響應(yīng)表達(dá)確認(rèn)炎癥模型構(gòu)建成功。

2 麥盧卡蜂蜜對HepG2和Caco-2細(xì)胞活性影響

如圖5所示，不同質(zhì)量濃度（5.00、10.00、15.00、20.00、25.00、30.00 mg/mL）的麥盧卡蜂蜜對HepG2和Caco-2細(xì)胞的存活率影響不同。在低于或等于20.00 mg/mL的蜂蜜質(zhì)量濃度條件下，兩種細(xì)胞的存活率均接近100%，未觀察到顯著毒性（P＞0.05），表明低質(zhì)量濃度蜂蜜對細(xì)胞的增殖無抑制作用，且具有良好的生物相容性。然而，當(dāng)質(zhì)量濃度增加至25.00 mg/mL及以上時，細(xì)胞存活率顯著下降（P＜0.05），其中在25.00 mg/mL和30.00 mg/mL時，HepG2細(xì)胞的存活率分別降至70.23%和59.33%，同時Caco-2細(xì)胞則降至67.93%和65.84%。這表明高質(zhì)量濃度麥盧卡蜂蜜對細(xì)胞增殖產(chǎn)生抑制作用或毒性效應(yīng)。

根據(jù)實驗結(jié)果分析，在后續(xù)研究中，應(yīng)優(yōu)先選擇蜂蜜質(zhì)量濃度低于20.00 mg/mL作為研究劑量，以避免對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。

3 麥盧卡蜂蜜對LPS誘導(dǎo)HepG2和Caco-2細(xì)胞中炎癥因子基因表達(dá)的影響

通過qPCR分析了LPS不同誘導(dǎo)時間（1、6、12 h）條件下對HepG2和Caco-2細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-6、NF-κB p65、COX-2基因表達(dá)的影響，以及麥盧卡蜂蜜對其表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。如圖6所示，炎癥因子的響應(yīng)結(jié)果在不同時間段和不同細(xì)胞系中有所不同。在LPS誘導(dǎo)后的早期反應(yīng)（1 h），HepG2細(xì)胞中主要的炎癥因子為IL-6和IL-1β，而Caco-2細(xì)胞是TNF-α和IL-1β。在反應(yīng)進行6 h后，HepG2細(xì)胞的下游基因COX-2開始迅速響應(yīng)并表達(dá)，并在12 h后達(dá)到穩(wěn)定的高水平，成為主要的炎癥因子。而Caco-2細(xì)胞中，6 h時NF-κB通路的核心因子p65和IL-6仍然是主要的炎癥因子，12 h后成為最顯著的炎癥因子。

隨著麥盧卡蜂蜜質(zhì)量濃度的增加（2.50、5.00、10.00、20.00 mg/mL），LPS誘導(dǎo)的炎癥因子基因表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。在不同時間不同細(xì)胞，麥盧卡蜂蜜質(zhì)量濃度為10.00 mg/mL時，LPS誘導(dǎo)的炎癥因子基因表達(dá)均顯著低于LPS組，接近對照組水平。

4 麥盧卡蜂蜜對LPS誘導(dǎo)Caco-2和HepG2細(xì)胞中相關(guān)炎癥蛋白的影響

為進一步驗證qPCR分析結(jié)果，通過ELISA法分析了HepG2和Caco-2細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-6、NF-κB p65和COX-2的蛋白表達(dá)水平。由圖7可知，ELISA實驗結(jié)果與qPCR結(jié)果相印證，LPS誘導(dǎo)后，細(xì)胞中上述炎癥因子的表達(dá)量在不同時間點存在顯著變化。在LPS刺激后，HepG2細(xì)胞于早期（1 h）中IL-6與IL-1β的蛋白表達(dá)水平明顯升高，6～12 h時COX-2蛋白表達(dá)水平逐漸升高；而Caco-2細(xì)胞中，早期（1 h）主要表現(xiàn)為TNF-α和IL-1β表達(dá)水平升高，6 h時NF-κB p65和IL-6表達(dá)增強，至12 h則以COX-2為主要炎癥因子。與單獨LPS處理組相比，10.00 mg/mL麥盧卡蜂蜜對炎癥因子蛋白的表達(dá)抑制作用最為顯著，而20.00 mg/mL麥盧卡蜂蜜的抗炎能力相較10.00 mg/mL略有減弱（P＜0.05），進一步驗證了qPCR分析的趨勢。

討論與結(jié)論

Caco-2細(xì)胞常用于研究腸道炎癥反應(yīng)及屏障功能保護，HepG2細(xì)胞則常用于揭示肝臟在炎癥和免疫調(diào)控中的作用。本研究基于Caco-2細(xì)胞和HepG2細(xì)胞構(gòu)建LPS誘導(dǎo)的炎癥損傷模型，揭示了麥盧卡蜂蜜在不同質(zhì)量濃度下對LPS不同時間誘導(dǎo)下的炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用，明確了其主要通過NF-κB信號通路實現(xiàn)抗炎效果。結(jié)合兩種不同細(xì)胞模型，可為解析麥盧卡蜂蜜在腸道和肝臟炎癥中的作用提供更為全面的視角，并為其在炎癥性疾病治療中的應(yīng)用提供依據(jù)。

LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中的主要成分，LPS誘導(dǎo)通常導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)炎癥信號迅速啟動，進一步釋放大量炎癥因子，從而引發(fā)急性或慢性炎癥反應(yīng)，廣泛用于體外細(xì)胞實驗，作為建立炎癥模型的經(jīng)典工具。本研究探討了麥盧卡蜂蜜對LPS誘導(dǎo)的HepG2和Caco-2細(xì)胞炎癥抵抗作用，通過LPS誘導(dǎo)建立炎癥模型，評估在不同時間點（1、6、12 h）以及不同質(zhì)量濃度（2.50、5.00、10.00、20.00 mg/mL）條件下，麥盧卡蜂蜜對關(guān)鍵炎癥因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、NF-κB p65、COX-2）的基因和蛋白水平表達(dá)的調(diào)控作用。不同劑量的LPS對細(xì)胞起到的作用不同，不同的細(xì)胞對于LPS的耐受濃度也不同，研究通過CCK-8法和顯微鏡觀察法進行對誘導(dǎo)濃度的初得選，發(fā)現(xiàn)用1.00 μg/mL LPS誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞時，細(xì)胞活性處于正常對照組水平，同時細(xì)胞形態(tài)明顯變長、有黏連，但不引起細(xì)胞死亡，同時在不同誘導(dǎo)時間下相關(guān)炎癥因子的相對表達(dá)量均顯著性上升；而誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞時，2.00 μg/mL LPS能夠和上述誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞炎癥效果相同，細(xì)胞緊密連接結(jié)構(gòu)會消失。不同細(xì)胞對LPS誘導(dǎo)的敏感性以及不同細(xì)胞表面TLR4受體的表達(dá)水平和下游信號通路的敏感性差異會影響LPS的誘導(dǎo)濃度。

麥盧卡蜂蜜在調(diào)控炎癥反應(yīng)中展現(xiàn)出良好的降低炎癥因子水平的作用，炎癥反應(yīng)作為一個由先天免疫系統(tǒng)驅(qū)動的動態(tài)過程，通?？蓜澐譃閱?、放大與維持3 個階段，而這一過程在分子層面上高度依賴NF-κB信號通路的時序激活。在炎癥反應(yīng)的早期（1 h），TNF-α和IL-1β作為炎癥反應(yīng)的“急先鋒”，其mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著上升，是炎癥通路中最先被激活的關(guān)鍵分子，迅速合成并釋放至細(xì)胞外，招募中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞向炎癥區(qū)域聚集，從而啟動急性炎癥反應(yīng)。TNF-α與IL-1β作為NF-κB通路直接靶基因，是通路活化的早期敏感指標(biāo)。隨著炎癥反應(yīng)進入中期（6 h），IL-6的表達(dá)達(dá)到高峰，其作為轉(zhuǎn)錄后響應(yīng)分子，標(biāo)志著炎癥信號從初始應(yīng)答向系統(tǒng)性擴展轉(zhuǎn)變。IL-6不僅受NF-κB調(diào)控，還能進一步激活Janus激酶/STAT3通路，形成正反饋放大環(huán)路，持續(xù)增強炎性信號。這一階段通常反映了細(xì)胞已完成初期基因應(yīng)答，轉(zhuǎn)向蛋白水平的功能執(zhí)行。

在炎癥反應(yīng)的后期（12 h），COX-2持續(xù)高表達(dá)，作為NF-κB通路的下游基因，表現(xiàn)出啟動延遲但維持時間長的特征。COX-2通過催化前列腺素（如前列腺素E2）的合成，擴張血管、促進炎癥細(xì)胞浸潤和刺激痛覺感受器，從而維持炎癥微環(huán)境的活躍狀態(tài)。麥盧卡蜂蜜對COX-2的表達(dá)顯著抑制，進一步表明其具有干預(yù)NF-κB信號通路末端效應(yīng)的能力，有助于降低慢性炎癥形成的風(fēng)險。該系列變化與NF-κB通路的激活過程高度相關(guān)：LPS誘導(dǎo)的TLR4信號引導(dǎo)p65亞基從細(xì)胞質(zhì)釋放至細(xì)胞核，啟動炎癥相關(guān)基因的持續(xù)表達(dá)。TNF-α和IL-1β啟動免疫應(yīng)答，IL-6推動炎癥信號擴展，COX-2維持慢性炎癥狀態(tài)，構(gòu)成NF-κB通路調(diào)控下炎癥因子的時序表達(dá)鏈條。研究還發(fā)現(xiàn)。這一規(guī)律在HepG2和Caco-2兩種細(xì)胞模型中表現(xiàn)出不同的響應(yīng)特征：HepG2細(xì)胞作為肝細(xì)胞模型，表現(xiàn)出快速而短暫的炎癥反應(yīng)，可能與其內(nèi)源性負(fù)反饋機制有關(guān)；而Caco-2細(xì)胞作為腸道屏障模型，其炎癥因子峰值出現(xiàn)相對滯后，可能與其屏障功能及信號調(diào)控的復(fù)雜性相關(guān)。在干預(yù)實驗中，麥盧卡蜂蜜對炎癥因子的蛋白表現(xiàn)出顯著抑制作用，尤其質(zhì)量濃度為10.00 mg/mL時，其抑制炎癥因子效果最為顯著，而質(zhì)量濃度提升至20.00 mg/mL時，炎癥因子的抑制效果反而減弱。這一現(xiàn)象可由Masad等的研究解釋：當(dāng)麥盧卡蜂蜜超過1%（相當(dāng)于10.00 mg/mL）時，盡管不表現(xiàn)細(xì)胞毒性，但是能夠增強促炎反應(yīng)，從而抵消部分抑制效果。

綜上所述，麥盧卡蜂蜜可通過抑制NF-κB通路及其下游炎癥因子的表達(dá)，展現(xiàn)出顯著的抗炎效果。在不同麥盧卡蜂蜜處理質(zhì)量濃度和LPS不同誘導(dǎo)時間條件下，其抗炎作用的差異性可為理解天然產(chǎn)物在炎癥調(diào)控過程中的作用機制提供重要線索，同時也體現(xiàn)出其在腸道和肝臟炎癥性疾病治療中的潛在應(yīng)用價值。然而，本研究未深入探討麥盧卡蜂蜜中具體活性成分的分子靶點，未來研究應(yīng)結(jié)合多組學(xué)技術(shù)進一步闡明其分子機制，并在體內(nèi)模型中驗證其抗炎效果，為開發(fā)基于天然產(chǎn)物的抗炎治療策略提供新方向。

本文《麥盧卡蜂蜜對脂多糖誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用》來源于《食品科學(xué)》2023年46卷第18期122-131頁，作者：周小玲，趙 微，葉子弘，張雅芬 *。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250116-122。點擊下方 閱讀原文 即可查看文章相關(guān)信息。

實習(xí)編輯：欒文莉；責(zé)任編輯：張睿梅。點擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網(wǎng)