果聚糖是由

-(2,6)-糖苷鍵主鏈和少量

-(2,1)-支鏈構(gòu)成的天然多糖，其生物相容性、可降解性及多功能特性使其在食品、醫(yī)藥和生物材料領(lǐng)域備受關(guān)注。

果聚糖的合成依賴于果聚糖蔗糖酶（EC 2.4.1.10），其具有水解和轉(zhuǎn)果糖基活性，該酶以蔗糖為底物通過non-Leloir機制催化蔗糖生成

-(2,6)-果聚糖。檸檬明串珠菌（

Leuconostoc citreum

）作為革蘭氏陽性厭氧菌，是一種安全的食品級微生物，其代謝多樣性（如右旋糖苷與交替糖合成能力）為功能多糖開發(fā)提供了優(yōu)質(zhì)資源。盡管菌株

L. citreum

BD1707已被證實具備果聚糖合成能力，但其合成路徑中關(guān)鍵酶尚未明確?；诨蚪M挖掘在檸檬明串珠菌BD1707中鑒定出2 個果聚糖蔗糖酶編碼基因（Lc-SacB1和Lc-SacB2）后，本研究旨在解析雙基因的催化功能分化機制及挖掘新型酶資源。

光明乳業(yè)股份有限公司光明乳業(yè)研究院的楊婷通過采用異源表達技術(shù)驗證雙酶活性差異，結(jié)合生物信息學(xué)分析（三維結(jié)構(gòu)建模及關(guān)鍵功能域?qū)Ρ龋?、酶學(xué)性質(zhì)表征（最適條件、金屬離子效應(yīng)、動力學(xué)參數(shù)）及產(chǎn)物結(jié)構(gòu)解析（核磁共振、分子質(zhì)量測定）系統(tǒng)探究雙酶的催化特性與結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，并探討雙基因功能分化的潛在機制，旨在為新型酶資源的開發(fā)與分子改造奠定理論基礎(chǔ)。

1

果聚糖蔗糖酶基因挖掘與保守結(jié)構(gòu)域解析

基于基因組測序分析，

L. citreum

BD1707基因組中鑒定出2 個連續(xù)排列的GH68成員基因（ORF1291與ORF1292），分別編碼1 188 個和1 215 個氨基酸殘基（圖1A）。結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果表明，Lc-SacB1與Lc-SacB2均包含N端信號肽、糖苷水解酶催化結(jié)構(gòu)域及7 個SH3_8折疊結(jié)構(gòu)域。

進一步通過多序列比對發(fā)現(xiàn)，盡管不同來源果聚糖蔗糖酶存在顯著種屬差異，但其核心催化域呈現(xiàn)高度保守性。以首個解析晶體結(jié)構(gòu)的

B. subtilis

來源果聚糖蔗糖酶（PDB∶1OYG）為參考（圖1B），Lc-SacB1/Lc-SacB2在以下關(guān)鍵功能域中完全保守：1）催化三聯(lián)體Asp86-Glu342-Asp247（紅色星號），直接參與質(zhì)子轉(zhuǎn)移與糖苷鍵斷裂；2）RDP基序Arg246-Asp247-Pro248（藍色虛框），負責(zé)底物特異性識別；3）DEIER基序Asp340-Glu341-Ile342-Glu343-Arg344（藍色虛框），調(diào)控果糖鏈延伸過程。上述保守特征從分子層面證實雙酶具備典型果聚糖蔗糖酶的催化功能。

通過EMBL-EBI數(shù)據(jù)庫進行同源性分析，結(jié)果顯示Lc-SacB1與Lc-SacB2的氨基酸序列同源性為79%，與

Fructilactobacillus sanfranciscensis

來源果聚糖蔗糖酶的最高同源性分別為43.92%和41.75%，表明二者在GH68中具有獨特進化地位。通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析，進一步揭示Lc-SacB1/Lc-SacB2與

F. sanfranciscensis

來源果聚糖蔗糖酶具有更密切的進化關(guān)系（圖1C）。

2

重組酶的異源表達

為驗證Lc-SacB1與Lc-SacB2的催化功能，本研究構(gòu)建了含目標基因的重組表達質(zhì)粒（圖2A），并將其轉(zhuǎn)化至

E. coli

BL21（DE3）中進行誘導(dǎo)表達。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，細胞裂解液經(jīng)初步活性檢測顯示顯著的蔗糖降解活性。進一步通過Ni2＋親和層析柱純化獲得高純度重組蛋白，結(jié)果如圖2B所示。Lc-SacB1與Lc-SacB2在約130 kDa處均呈現(xiàn)單一且清晰的蛋白條帶，與ExPASy數(shù)據(jù)庫預(yù)測值（Lc-SacB1：126 kDa；Lc-SacB2：130 kDa）高度吻合，證實二者在大腸桿菌系統(tǒng)中成功表達且在純化過程中未引入雜蛋白。值得注意的是，Lc-SacB2的分子質(zhì)量（130 kDa）顯著高于已報道的多數(shù)同源酶：如

B. licheniformis RN-01

（56 kDa）、

Bacillus sp. TH4-2

（56 kDa）、

Clostridium acetobutylicum

（56 kDa）及

Halomonas smyrnensis AAD6T

（47.3 kDa）來源酶，而

L. mesenteroides

NTM048來源酶（113 kDa）的分子質(zhì)量亦低于Lc-SacB2。上述結(jié)果表明，Lc-SacB2是迄今已知分子質(zhì)量最大的果聚糖蔗糖酶，其獨特的結(jié)構(gòu)特征可能與其擴展的功能域（如SH3_8結(jié)構(gòu)重復(fù)單元）相關(guān)。

3

酶學(xué)性質(zhì)分析

溫度是調(diào)控酶空間構(gòu)象及催化效能的關(guān)鍵環(huán)境因子。為探究重組酶的溫敏特性，本實驗評估了Lc-SacB1與Lc-SacB2在4～50 ℃范圍內(nèi)的活性變化。如圖3A所示，二者活性變化趨勢高度一致，隨溫度升高相對酶活力逐漸增強，30 ℃時達到峰值；當溫度超過35 ℃后，酶活性被顯著抑制，40 ℃時Lc-SacB2和Lc-SacB1的相對酶活力分別僅為21.3%和18.9%。對比研究表明，不同來源果聚糖蔗糖酶的最適溫度存在顯著種屬差異，如

H. smyrnensis

AAD6T來源酶的最適溫度低至15 ℃。

由圖3B可知，Lc-SacB1與Lc-SacB2的最適pH值分別為6.0和5.5，且二者在寬泛pH值范圍內(nèi)（Lc-SacB1：5.5～7.0；Lc-SacB2：5.0～6.0）仍能維持大于80%的相對酶活力，表現(xiàn)出良好的環(huán)境適應(yīng)性。當pH≥8.0時，Lc-SacB1與Lc-SacB2活性急劇喪失。此特性與多數(shù)已報道果聚糖蔗糖酶的最適pH值相符，如

B. halotolerans

來源酶的最適pH值為5.5～6.0，

L. mesenteroides

MTCC10508來源酶的最適pH值為5.5。上述結(jié)果表明，Lc-SacB1與Lc-SacB2的pH值適應(yīng)性與其來源菌株

L. citreum

BD1707的天然發(fā)酵環(huán)境（通常為pH 5.0～6.5）存在顯著生態(tài)關(guān)聯(lián)性。

在體系最適溫度和最適pH值條件下，分析了10 mmol/L不同金屬離子對2 種重組酶活性的影響。如圖3C所示，Ca2＋對Lc-SacB1與Lc-SacB2活性具有明顯的促進作用，其相對酶活力分別提升了155%和134%。與之相反，Zn2＋與Cu2＋均表現(xiàn)出明顯的抑制作用，其中Cu2＋的抑制作用最為顯著，導(dǎo)致酶活性幾乎完全失活。結(jié)果表明，這2 種重組酶對上述金屬離子具有較高敏感性。EDTA作為金屬離子螯合劑，使Lc-SacB1和Lc-SacB2的相對酶活力均顯著下降，這與Ca2＋等金屬離子激活組形成對比，表明這2 種酶的催化功能可能依賴金屬離子。

4

動力學(xué)參數(shù)

本研究進一步測定了2 種重組酶在不同濃度蔗糖溶液中的反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)，結(jié)果如表1所示。通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法計算得出，重組Lc-SacB1與Lc-SacB2對蔗糖的

K

m

分別為（9.8±0.5）mmol/L和（81.1±7.1）mmol/L，表明Lc-SacB1對底物具有顯著更高的結(jié)合親和力。Lc-SacB1、Lc-SacB2與不同來源果聚糖蔗糖酶的

K

m

相比差異顯著，例如運動發(fā)酵單胞菌（

Zymomonas mobilis

）與

H. smyrnensis

AAD6T的

K

m

分別為160 mmol/L和104.79 mmol/L，這表明本實驗獲得的2 種重組酶對蔗糖的底物親和力具有相對優(yōu)勢。Lc-SacB1與Lc-SacB2的催化常數(shù)（

K

cat

）分別為（0.28±0.01） s -1 和（3.90±0.70） s -1 ，表明后者具備更強的單位時間催化能力。由表1可知，Lc-SacB2的綜合催化效率（ Kcat / Km ＝0.048 L/（s·mmol））略優(yōu)于Lc-SacB1（0.029 L/（s·mmol））?；谏鲜鰟恿W(xué)特征表明Lc-SacB2具有高催化速率優(yōu)勢，使其在工業(yè)化生物轉(zhuǎn)化過程中（如規(guī)模化糖基化合物制備）具有顯著應(yīng)用潛力。

5

重組酶轉(zhuǎn)果糖基活性驗證與產(chǎn)物特性分析

如表2所示，重組Lc-SacB2在催化蔗糖1 h后，體系中葡萄糖與果糖質(zhì)量濃度分別為242.9 μg/mL和129.7 μg/mL；反應(yīng)24 h時，二者分別增至581.5 μg/mL和272.4 μg/mL，不同反應(yīng)時間下葡萄糖生成量均顯著高于果糖。結(jié)合24 h蔗糖消耗率（97.89%），表明Lc-SacB2的活性高，能夠?qū)⒄崽侵饕D(zhuǎn)化為果聚糖及葡萄糖。相較之下，Lc-SacB1催化體系在1 h與24 h的葡萄糖和果糖含量均無顯著差異，結(jié)果表明其僅保留水解活性，缺乏果聚糖合成能力。為進一步驗證酶功能分化特性，本研究采用蛋白膠原位活性檢測法進行分析。僅Lc-SacB2在130 kDa處呈現(xiàn)特征性白色條帶（圖4A），且反應(yīng)產(chǎn)物呈高黏度凝膠狀（圖4B），而Lc-SacB1組未見果聚糖生成。上述結(jié)果從催化動力學(xué)與產(chǎn)物形態(tài)雙重角度證實，Lc-SacB2為功能性果聚糖蔗糖酶，而Lc-SacB1僅有水解活性。

6

果聚糖結(jié)構(gòu)解析

通過NMR（1H NMR和13C NMR）解析產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)（表3）。13C NMR中，異頭碳區(qū)（δ 95～110）δ 104.2處特征峰歸屬為β-呋喃果糖C2信號；環(huán)碳區(qū)（δ 50～85）δ 59.9、δ 76.3、δ 75.2、δ 80.3及δ 63.4處的信號分別對應(yīng)果糖殘基C1、C3、C4、C5和C6，其中C6化學(xué)位移（δ 63.4）明確指示β-(2,6)-糖苷鍵的存在。1H NMR分析顯示，果糖環(huán)質(zhì)子信號（δ 3.4～4.2）包含7 個特征峰：H3（δ 4.20）、H4（δ 4.11）、H5（δ 3.97）、H6a（δ 3.90）、H1a（δ 3.77）、H1b（δ 3.68）及H6b（δ 3.57），各峰積分面積比為1∶1∶1∶1∶1∶1∶1，證實產(chǎn)物為均一β-(2,6)-果聚糖。上述結(jié)果與已報道果聚糖蔗糖酶合成產(chǎn)物的波譜特征高度一致，從分子層面確證了Lc-SacB2的催化特異性。進一步測定果聚糖分子質(zhì)量，結(jié)果顯示重組Lc-SacB2催化合成的果聚糖分子質(zhì)量為4.0×106 Da（圖5），為高分子質(zhì)量果聚糖。

7

因果聚糖具有益生元、生物功能特性相關(guān)的健康優(yōu)勢，使越來越多的研究人員專注于開發(fā)使用高度生物催化酶的高效生產(chǎn)方法。本研究首次在厭氧菌L. citreum BD1707中揭示了果聚糖蔗糖酶雙基因（Lc-SacB1/Lc-SacB2）的功能分化現(xiàn)象，其催化特性與結(jié)構(gòu)進化機制為糖基轉(zhuǎn)移酶的功能多樣性研究提供了新視角。

相較于傳統(tǒng)芽孢桿菌來源的果聚糖蔗糖酶，Lc-SacB2展現(xiàn)出獨特的催化優(yōu)勢。其Kcat為3.90 s-1，顯著高于已報道的多數(shù)同源酶，如B. subtilis來源的果聚糖蔗糖酶（Kcat為0.12 s-1）。此外，重組酶Lc-SacB2合成的果聚糖分子質(zhì)量達到4.0×106 Da，顯著優(yōu)于多數(shù)微生物來源酶的產(chǎn)物。與同類酶相比Lc-SacB2具有顯著優(yōu)勢。例如B. subtilis來源果聚糖蔗糖酶的產(chǎn)物呈雙峰分布，其中高分子質(zhì)量組分（約2×106 Da）占比不足6%，主要產(chǎn)物為低分子質(zhì)量果聚糖（約7×103 Da）；

B. methylotrophicus

SK 21.002和

B. licheniformis

RN-01的產(chǎn)物分子質(zhì)量分別僅為5×103 Da和0.11×105～6.12×105 Da；T. sakaeratensis和A. diazotrophicus SRT4的產(chǎn)物分子質(zhì)量分別為1.0×105～6.8×105 Da和2.0×106 Da 。高分子質(zhì)量果聚糖（＞5×104 Da）在功能應(yīng)用上展現(xiàn)出獨特優(yōu)勢：分子質(zhì)量超過3×105 Da的產(chǎn)物具有顯著抗腫瘤活性，而7×104 Da左右的果聚糖對H5N1禽流感病毒及腺病毒40型表現(xiàn)出廣譜抗病毒活性。在食品領(lǐng)域，高分子質(zhì)量果聚糖作為益生元可有效調(diào)節(jié)腸道菌群，降低血清膽固醇及甘油三酯水平。為提升高分子質(zhì)量果聚糖合成能力，研究者常采用分子改造策略，如Li Zhiwei等通過在SacB酶C端融合葡聚糖結(jié)合域，將產(chǎn)物分子質(zhì)量提升至2×106 Da。本研究中Lc-SacB2無需結(jié)構(gòu)修飾即可合成高分子質(zhì)量（4.0×106 Da）果聚糖，其機制可能源于底物結(jié)合域中擴展的SH3_8結(jié)構(gòu)域——該結(jié)構(gòu)通過增加底物通道的空間容納能力，顯著促進果糖鏈的持續(xù)延伸。

本研究揭示了Lc-SacB1與Lc-SacB2在催化功能上存在顯著分化現(xiàn)象。盡管二者序列同源性高達79%，但Lc-SacB1僅保留水解活性，而Lc-SacB2兼具高效的轉(zhuǎn)果苷活性。通過三維結(jié)構(gòu)建模與功能域?qū)Ρ劝l(fā)現(xiàn)，二者底物結(jié)合域的局部構(gòu)象差異是功能分化的關(guān)鍵分子基礎(chǔ)。Lc-SacB1的催化通道入口處存在一段由Thr316至Met325組成的延伸loop結(jié)構(gòu)（圖6B玫瑰紅標注區(qū)），其關(guān)鍵殘基Lys322和Gln323的較長側(cè)鏈向催化口袋內(nèi)部延伸，導(dǎo)致通道空間顯著狹窄化。這一構(gòu)象特征與B. subtilis來源果聚糖蔗糖酶的開放型底物通道形成鮮明對比（圖6A），推測其阻礙了蔗糖分子進入活性中心并形成催化過渡態(tài)，從而抑制轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)，僅保留水解功能。相比之下，Lc-SacB2對應(yīng)區(qū)域（Glu346至Ala347）的側(cè)鏈較短且空間取向更為靈活（圖6C），形成與B. subtilis來源果聚糖蔗糖酶相似的開放型通道構(gòu)象。這一結(jié)構(gòu)優(yōu)勢不僅提升了底物分子的可及性，還為果糖鏈的延伸提供了更大的空間容納能力，從而支持高分子質(zhì)量果聚糖（4.0×106 Da）的高效合成。后續(xù)將對Lc-SacB1 Thr316至Met325組成的loop區(qū)域進行丙氨酸突變，檢測突變體是否恢復(fù)轉(zhuǎn)果糖基活性，以及通過分子動力學(xué)模擬解析底物結(jié)合過程中l(wèi)oop區(qū)構(gòu)象的動態(tài)變化，闡明其如何調(diào)控蔗糖分子的空間取向與催化中間態(tài)形成。

本研究合成的β-(2,6)-果聚糖因具有高分子質(zhì)量特性，在功能應(yīng)用上展現(xiàn)出獨特潛力。已有研究表明，高分子質(zhì)量果聚糖較傳統(tǒng)低分子質(zhì)量產(chǎn)物具有更強的黏彈性、抗氧化活性及免疫調(diào)節(jié)功能，可拓展至食品質(zhì)構(gòu)改良、藥物緩釋載體及功能性化妝品開發(fā)等領(lǐng)域。然而，Lc-SacB2的產(chǎn)物分子質(zhì)量分布調(diào)控機制仍需深入解析，未來可通過定向進化或底物工程優(yōu)化其產(chǎn)物均一性。此外，雙基因在宿主菌中的協(xié)同代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚未明確，需結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)與代謝通量分析揭示其生理意義，為合成生物學(xué)改造提供靶點。

綜上，Lc-SacB2的發(fā)現(xiàn)不僅豐富了果聚糖蔗糖酶資源庫，其功能分化機制與高效催化特性為工業(yè)酶理性設(shè)計提供了新思路。后續(xù)研究將聚焦于其晶體結(jié)構(gòu)解析與關(guān)鍵功能域定點突變，以進一步強化催化效率及產(chǎn)物可控性，推動果聚糖生物制造的產(chǎn)業(yè)化進程。

結(jié) 論

本研究通過基因組挖掘、異源表達與酶學(xué)表征，系統(tǒng)揭示了檸檬明串珠菌BD1707中果聚糖蔗糖酶Lc-SacB1/Lc-SacB2的功能分化機制及催化特性。Lc-SacB2表現(xiàn)出高效轉(zhuǎn)果苷活性，催化蔗糖生成分子質(zhì)量達4.0×106 Da的β-(2,6)-果聚糖，而Lc-SacB1因局部結(jié)構(gòu)差異僅保留水解功能。動力學(xué)分析表明，Lc-SacB2的催化效率（Kcat/Km＝0.048 L/（s·mmol））略優(yōu)于Lc-SacB1。通過分析2 種重組酶的環(huán)境適應(yīng)性發(fā)現(xiàn)，Ca2＋通過穩(wěn)定催化構(gòu)象顯著提升雙酶活性（Lc-SacB1、Lc-SacB2相對酶活力分別提高了155%和134%）。Lc-SacB2合成的高分子質(zhì)量果聚糖可能兼具益生元、抗氧化等生物活性，在食品增稠、醫(yī)藥載體等領(lǐng)域展現(xiàn)出應(yīng)用潛力。本研究不僅可為果聚糖高效生物制造提供優(yōu)質(zhì)酶資源，還可為糖基轉(zhuǎn)移酶的功能進化與理性改造奠定理論基礎(chǔ)。

作者簡介

第一作者：

楊婷，博士，現(xiàn)任光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院項目主管。2023年獲華東師范大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)博士學(xué)位，同年加入乳業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室。長期從事合成生物學(xué)與乳業(yè)生物制造研究，主要方向包括：食品級微生物（枯草芽孢桿菌/馬克斯克魯維酵母）底盤細胞工廠設(shè)計；食品酶（淀粉分支酶/蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶）高效表達與分子改造；功能性多糖的生物合成與產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。研究成果發(fā)表

于AMB Express、Current Microbiology、Nutrients

等SCI期刊，申請中國發(fā)明專利10 項。參與十四五國家重點研發(fā)計劃項目（2022YFD2100704）；市國資委企業(yè)創(chuàng)新發(fā)展和能級提升項目（2022013）。

本文《檸檬明串珠菌BD1707果聚糖蔗糖酶功能分化及酶學(xué)特性》來源于《食品科學(xué)》2025年46卷第20期153-161頁，作者：楊婷。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250407-042。點擊下方閱讀原文即可查看文章相關(guān)信息。

實習(xí)編輯：楊倩；責(zé)任編輯：張睿梅。點擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網(wǎng)。