紅曲黃色素（MYP）作為紅曲霉屬真菌產(chǎn)生的聚酮類次級代謝產(chǎn)物，已被證實(shí)具有抗肥胖、抗糖尿病及抗氧化等多種生物活性。然而，MYP存在水溶性和穩(wěn)定性差的問題，限制了其生物利用度和應(yīng)用潛力。

納米遞送系統(tǒng)已成為改善功能性成分生物利用度的有效策略之一。唾液糖蛋白受體（ASGPR）在肝細(xì)胞表面高表達(dá)，利用ASGPR作為納米顆粒靶向配體的策略備受關(guān)注。有研究表明，半乳糖基化殼聚糖（GC）能夠特異性識別ASGPR，促進(jìn)功能性成分靶向遞送到肝細(xì)胞。因此，利用半乳糖基納米載體靶向肝細(xì)胞表面的ASGPR是一種具有前景的肝臟遞送策略，用于改善脂質(zhì)沉積。

浙江工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院的林楊、孫思邈、邵平*等采用玉米醇溶蛋白作為核心載體包埋MYP，再以GC作為外層包覆材料，構(gòu)建了靶向肝細(xì)胞ASGPR的MYP-GC納米顆粒，并評價其改善肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積的效果，以期為提高M(jìn)YP生物利用度提供新的思路，并為MYP及其遞送系統(tǒng)在緩解脂質(zhì)沉積方面的應(yīng)用提供理論參考。

01

MYP的紫外-可見光譜分析

如圖1所示，MYP的紫外-可見光譜在233 nm和392 nm波長處分別呈現(xiàn)出2 個明顯的吸收峰。這2 個吸收峰都是MYP的特征峰，MS和AK這2 種化合物共同導(dǎo)致了這些吸收峰。233 nm波長處的吸收峰與

α,β

-不飽和酮結(jié)構(gòu)中共軛雙鍵系統(tǒng)的電子躍遷有關(guān)，這一特征在MS和AK中均有體現(xiàn)。而392 nm波長處的吸收峰則源于羰基孤對電子的電子躍遷，并受到分子中擴(kuò)展共軛系統(tǒng)的增強(qiáng)作用。

02

MYP中MS和AK含量的分析

MYP是通過紅曲菌固態(tài)或液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的次生代謝產(chǎn)物，常見的MYP主要成分包括MS和AK，為了準(zhǔn)確測定MYP中MS和AK的含量，通過電噴霧質(zhì)譜分析它們的保留時間和分子質(zhì)量，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線定量其質(zhì)量濃度。如圖2A所示，在正離子模式下ESI提取后的目標(biāo)物質(zhì)MS可能在2.96 min出峰，其正離子模式一級質(zhì)譜圖顯示質(zhì)荷比為359.19的準(zhǔn)分子離子峰（[M＋H]+），確定其分子質(zhì)量為358 Da，這與文獻(xiàn)所報(bào)道的MS分子質(zhì)量一致。MS的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為

y

＝1 715.37

-21.927（

R

2 ＝0.999）。根據(jù)線性方程計(jì)算可知MYP中MS的含量為512.50 μg/mg。

如圖2B所示，使用ESI提取的AK在4.24 min處出峰。其正離子模式一級質(zhì)譜圖顯示出質(zhì)子化分子離子峰（[M＋H]+），質(zhì)荷比為387.22，對應(yīng)的分子質(zhì)量為386 Da，與文獻(xiàn)中報(bào)道的AK分子質(zhì)量一致。AK的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為

y

＝1 594.73

-77.696（

R

2 ＝0.999）。根據(jù)線性方程計(jì)算可知MYP中AK的含量為182.50 μg/mg。本研究中的MYP主要成分為MS和AK，這表明其具有提供健康益處的巨大潛力，但仍有少量成分未被明確。有研究表明，紅曲霉（

Monascus

）可產(chǎn)生多種黃色素，除主要成分MS和AK外，還包括monaphilone A、monaphilone B、monasfluore A、monasfluore B、monascuspilion、monarubrin等。這些色素均屬于氮吡咯酮類化合物，具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)和紫外-可見光吸收特性，可能導(dǎo)致在色譜分析時出現(xiàn)重疊峰或相近的保留時間，增加了鑒定的復(fù)雜性。

03

GC的FTIR分析

如圖3所示，CS的紅外光譜呈現(xiàn)出其特有的吸收峰特征，其中1 654 cm-1處的吸收峰對應(yīng)于CS中的酰胺基，而3 448 cm-1處的寬峰則源于O—H和N—H的伸縮振動。LA在1 740 cm-1處存在一個窄且強(qiáng)度較高的吸收峰，這是羧基中C＝O雙鍵的特征吸收峰。當(dāng)LA的羧基與CS的氨基發(fā)生反應(yīng)后，GC的紅外光譜發(fā)生了明顯變化。原本LA羧基的C＝O吸收峰在GC中消失，而半乳糖C—O主鏈在1 076 cm-1處的吸收峰依然存在。此外，GC的酰胺基特征峰從1 654 cm-1藍(lán)移至1 596 cm-1，同時在3 420 cm-1處的O—H吸收峰變寬并增強(qiáng)，這一現(xiàn)象歸因于O—H數(shù)量的增加，Zheng Dandan等的研究表明，當(dāng)LA和CS之間形成酰胺鍵時，酰胺基團(tuán)的數(shù)量會增加，與本研究結(jié)果相同。綜上所述，F(xiàn)TIR分析結(jié)果從多個特征峰的變化情況驗(yàn)證了GC的成功合成。

04

GC的1HNMR分析

如圖4所示，重水（D2O）與氘代乙酸（CH3COOD）的溶劑峰分別出現(xiàn)在

4.79和

1.93處。CS的 1 H NMR譜圖顯示出典型的特征信號，包括來自葡糖胺骨架上質(zhì)子信號（

3.00～4.00）和對應(yīng)于殘留乙酰基的甲基質(zhì)子信號（

2.09）。GC譜圖在

3.5～4.5區(qū)域內(nèi)信號強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，這一變化可以歸因于半乳糖單元上質(zhì)子的貢獻(xiàn)。此外，在

4.24處出現(xiàn)了一個新的特征信號（H c ），該信號對應(yīng)于半乳糖異頭質(zhì)子的信號。CS譜圖中葡萄糖胺殘基C2位置的質(zhì)子信號（H 2 ）在GC譜圖中依然保持穩(wěn)定，化學(xué)位移為

3.04。H c 信號的出現(xiàn)以及整體譜圖的變化進(jìn)一步證實(shí)了半乳糖成功連接至CS骨架。根據(jù)GC譜中H c （

4.24）與H 2 （

3.04）信號的積分面積比，計(jì)算得到GC半乳糖基取代度為58%。Zhang Honghao等通過LA與CS反應(yīng)合成GC，其半乳糖基取代度為34%，相比之下，本實(shí)驗(yàn)合成GC的半乳糖基取代度更高。

05

納米顆粒的粒徑、PDI、ζ-電位、包封效率和負(fù)載效率

-電位常用于評估分散介質(zhì)中液滴的表面電荷，是衡量納米顆粒穩(wěn)定性的重要指標(biāo)。如表1所示，GC和玉米醇溶蛋白的ζ-電位分別為71.93 mV和-3.90 mV。相比之下，由玉米醇溶蛋白和GC組成的MYP-GC-NP

-電位為70.88 mV，接近GC的

-電位。這表明GC主要分布在MYP-GC-NP顆粒的表面。類似地，CS也位于MYPCS-NP顆粒的最外層。這些納米顆粒展現(xiàn)出3 層結(jié)構(gòu)，最外層為CS或GC，中間層為玉米醇溶蛋白，最內(nèi)層為MYP。此外，

-電位絕對值大于30 mV通常被認(rèn)為系統(tǒng)具有較高的穩(wěn)定性[。MYP-CS-NP（72.73 mV）和MYP-GC-NP（70.88 mV）較高的

-電位表明它們具有較好的穩(wěn)定性。

此外，MYP-GC-NP（（167.00±0.60）nm）的粒徑顯著大于MYP-CS-NP（（163.70±0.73）nm），可能是由于半乳糖的加入增加了CS的分子間距，導(dǎo)致其粒徑增大。PDI是衡量納米顆粒分布均勻性的一個重要指標(biāo)，反映了納米顆粒粒徑分布的寬窄程度。PDI較大表明粒徑分布較寬，均一性較差；而PDI較小則說明顆粒大小較為均一，趨于單分散性。納米顆粒形成后，其PDI為0.25±0.01，顯著低于玉米醇溶蛋白（0.31±0.03）、CS（0.52±0.15）和GC（0.48±0.05），表明納米顆粒的均勻性和分散性得到了顯著改善。較高的

-電位和較低的PDI表明納米顆粒具有良好穩(wěn)定性和均勻分散性。MYPCS-NP的包封效率和負(fù)載效率分別為63.75%和9.19%，而MYP-GC-NP的包封效率和負(fù)載效率分別為64.20%和10.43%。這些結(jié)果表明，MYP-CS-NP和MYP-GC-NP都具有較好的包封能力和負(fù)載能力，且兩者的包封效率和負(fù)載效率相近，表明不同載體材料對納米顆粒的載藥性能影響較小。

06

納米顆粒的FTIR分析

FTIR可以表征納米顆粒各物質(zhì)間的分子相互作用力。如圖5所示，玉米醇溶蛋白的紅外光譜呈現(xiàn)出多個特征峰，其中位于3 340 cm-1處的特征峰對應(yīng)于O—H的伸縮振動；2 960 cm-1處的特征峰歸因于C—H的伸縮振動；1 520 cm-1處的特征峰與N—H的伸縮振動相關(guān)；而1 450 cm-1處的特征峰則由—CH2—的伸縮振動引起。MYP-GC-NP的C＝O特征峰從1 650 cm-1移動到1 660 cm-1，而MYP-CS-NP的C＝O特征峰則從1 650 cm-1移動到1 654 cm-1。同時，1 520 cm-1處的N—H特征峰移至1 540 cm-1處，表明納米顆粒之間通過靜電相互作用結(jié)合。此外，MYP-GC-NP在3 340 cm-1處的吸收峰強(qiáng)度顯著高于MYP-CS-NP，這可能是由于引入半乳糖基團(tuán)，增加了—OH基團(tuán)的數(shù)量，從而增強(qiáng)了氫鍵的作用。FTIR分析表明，MYP-GC-NP和MYP-CS-NP的形成是由靜電相互作用和氫鍵驅(qū)動。

07

納米顆粒的SEM分析

玉米醇溶蛋白微觀形貌呈現(xiàn)出疏松多孔的大塊結(jié)構(gòu)，同時觀察到部分分布呈現(xiàn)較均勻的片狀結(jié)構(gòu)（圖6A），其疏松片狀結(jié)構(gòu)有利于自組裝過程中球形顆粒的形成，并能夠穩(wěn)定包裹疏水性成分。CS主要呈現(xiàn)較厚的片狀結(jié)構(gòu)（圖6B），而GC則呈現(xiàn)出較薄且柔韌的片層形貌（圖6C），這一差異可能與半乳糖修飾后分子鏈柔性增加和堆疊方式變化有關(guān)。CS分子鏈中存在大量氨基和羥基，易通過氫鍵形成緊密的結(jié)晶區(qū)域，導(dǎo)致片層較厚且剛性較強(qiáng)。而半乳糖基的引入會破壞原有的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，增加分子鏈的無序性和柔性，使GC的堆疊方式更松散，形成更薄且柔韌的片層結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀察了MYP-CS-NP（圖6D）和MYP-GC-NP（圖6E）的微觀形貌。2 種納米顆粒均呈現(xiàn)出球形結(jié)構(gòu)且分散均勻，沒有明顯的聚集或結(jié)塊現(xiàn)象，表明MYPGC-NP和MYP-CS-NP具有良好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。球形顆粒的形成可歸因于玉米醇溶蛋白的自組裝過程。具體而言，當(dāng)玉米醇溶蛋白的乙醇溶液滴加到水中時，體系內(nèi)乙醇濃度迅速降低，促使玉米醇溶蛋白大分子之間發(fā)生自組裝，最終形成球形顆粒。這種自組裝過程可能是由分子間作用力共同驅(qū)動，包括疏水作用、范德華力、靜電作用以及氫鍵作用。這些分子間作用力協(xié)同發(fā)揮作用，使得玉米醇溶蛋白大分子能夠有序地聚集和排列，進(jìn)而形成穩(wěn)定的球形顆粒結(jié)構(gòu)。

08

納米顆粒的在模擬胃腸環(huán)境中的穩(wěn)定性分析

MYP在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿條件下穩(wěn)定性較差，且容易受到金屬離子的影響而發(fā)生降解。由于胃腸道環(huán)境中pH值波動較大，且含有多種消化酶和金屬離子，這些因素可能會對納米顆粒的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。本研究通過模擬胃腸環(huán)境評估納米顆粒的穩(wěn)定性。MYP-CS-NP和MYP-GCNP在模擬胃腸液中的MYP釋放曲線如圖7所示，2 種納米顆粒的釋放曲線較為相似。在消化前2 h，納米顆粒處于SGF環(huán)境中，此時MYP-CS-NP和MYP-GC-NP的MYP釋放率分別為30.0%和25.0%。相較于MYP-CS-NP，MYPGC-NP的釋放速率更低，表明GC包覆能夠使MYP釋放速度更為緩慢，從而提高其在SGF環(huán)境中的穩(wěn)定性。在SIF環(huán)境中，經(jīng)過4 h消化后2 種納米顆粒的MYP釋放率明顯升高，分別達(dá)到54.0%和53.5%，可能是由于SIF中的胰蛋白酶水解了納米顆粒中的玉米醇溶蛋白[37]，從而促進(jìn)了MYP的釋放。綜上所述，MYP-CS-NP和MYP-GCNP在模擬胃腸環(huán)境中的釋放速率較為相似，但相對而言，MYP-GC-NP表現(xiàn)出更為緩慢的釋放速率，表明GC包覆對MYP的保護(hù)作用更強(qiáng)，可能是由于GC中引入的半乳糖基團(tuán)通過空間位阻效應(yīng)增強(qiáng)了納米顆粒外層的致密性，從而延緩了MYP的釋放。

09

MYP和納米顆粒對HepG2細(xì)胞存活率的影響

如圖8所示，經(jīng)0～20 μg/mL的MYP處理后，細(xì)胞存活率保持在90%以上。MYP-CS-NP和MYP-GC-NP均表現(xiàn)出相對較低的細(xì)胞毒性。經(jīng)質(zhì)量濃度小于200 μg/mL的納米顆粒處理后，HepG2細(xì)胞存活率均仍維持在90%以上。當(dāng)納米顆粒質(zhì)量濃度為200 μg/mL時（根據(jù)載藥率計(jì)算，此質(zhì)量濃度對應(yīng)約20 μg/mL的MYP），細(xì)胞存活率依然保持在90%以上。這一結(jié)果表明，在該質(zhì)量濃度范圍內(nèi)細(xì)胞對這2 種納米顆粒具有良好的耐受性?；谝陨蠈?shí)驗(yàn)結(jié)果，綜合考慮細(xì)胞對納米顆粒的耐受性以及納米顆粒中MYP的含量等因素，選擇200 μg/mL作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中納米顆粒的最佳質(zhì)量濃度。

10

納米顆粒對HepG2細(xì)胞的識別作用

DiI是一種常用的脂溶性熒光染料，當(dāng)其位于細(xì)胞膜外時熒光較弱，只有進(jìn)入到細(xì)胞膜后才能被激發(fā)并發(fā)出強(qiáng)烈的橙紅色熒光。如圖9所示，在用DiI標(biāo)記經(jīng)MYPCS-NP和MYP-GC-NP分別處理的HepG2細(xì)胞后，觀察到2 組細(xì)胞熒光強(qiáng)度存在明顯差異。經(jīng)MYP-CS-NP處理后的HepG2細(xì)胞呈現(xiàn)出微弱的紅色熒光，表明細(xì)胞對MYPCS-NP顆粒的攝取量較低。而相同條件下，MYP-GCNP處理的HepG2細(xì)胞則顯示出更強(qiáng)的熒光，這意味著細(xì)胞對MYP-GC-NP顆粒的攝取程度更高。結(jié)果表明，與MYP-CS-NP相比，MYP-GC-NP能夠更有效地在HepG2細(xì)胞內(nèi)積累。MYP-GC-NP的攝取量增加，可能由于半乳糖的引入促進(jìn)了納米顆粒與HepG2表面的ASGPR發(fā)生特異性結(jié)合。ASGPR能夠識別半乳糖殘基，并通過受體-配體的結(jié)合促進(jìn)半乳糖基化納米顆粒的攝取，從而提高納米顆粒的肝臟靶向效果。Huang Mian等通過制備新型半乳糖修飾的納米顆粒（GC@NPs）負(fù)載姜黃素，研究發(fā)現(xiàn)GC@NPs的細(xì)胞攝取量顯著高于未修飾的納米顆粒（CS@NPs），進(jìn)一步表明了半乳糖基化修飾能夠有效促進(jìn)納米顆粒在肝細(xì)胞中的攝取。

11

MYP及納米顆粒對HepG2細(xì)胞脂滴積累的影響

油紅O是一種脂溶性染色劑，能夠特異性地將細(xì)胞內(nèi)的脂滴染成紅色，是一種可視化脂質(zhì)積累的有效方法。如圖10所示，對照組未見明顯染色，表明在正常條件下細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)積累較少。相比之下，模型組細(xì)胞則呈現(xiàn)大量紅色聚集脂滴。通過MYP-CS-NP和MYP-GC-NP處理后，染色區(qū)域顯著減少。細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)水平分別減少了38.91%和47.20%（圖11）。相較而言，游離MYP組的脂質(zhì)染色減少程度較小，為30.49%。Zhang Honghao等制備了GC修飾的納米顆粒（GC-NPs）以負(fù)載柚皮素，并發(fā)現(xiàn)在OA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞模型中，GC-NPs比未經(jīng)GC修飾的納米顆粒（CS-NPs）和游離柚皮素具有更強(qiáng)的降脂作用。該研究指出，GC-NPs通過半乳糖基化結(jié)構(gòu)與肝細(xì)胞表面ASGPR結(jié)合，從而促進(jìn)柚皮素的靶向攝取，增強(qiáng)其生物活性。與此類似，本研究也發(fā)現(xiàn)MYPGC-NP能夠顯著減少模型組HepG2細(xì)胞中的脂滴積累（

P

＜0.05），效果優(yōu)于MYP-CS-NP和游離的MYP。這一現(xiàn)象可能是由于MYP-GC-NP中的半乳糖基化結(jié)構(gòu)可以被肝細(xì)胞表面的ASGPR識別，從而促進(jìn)MYP的攝取，增強(qiáng)了其在HepG2細(xì)胞中的降脂效果。

12

MYP、納米顆粒對HepG2細(xì)胞TG、TC含量的影響

TG和TC是反映體內(nèi)脂質(zhì)代謝水平的重要指標(biāo)，常用于評估脂質(zhì)沉積情況。由圖12可知，與模型組相比，MYP及其納米顆粒處理明顯降低了HepG2細(xì)胞的TG和TC水平。經(jīng)MYP、MYP-CS-NP和MYP-GC-NP處理后，TG水平分別顯著降低了42.91%、44.54%和65.48%（

P

＜0.05），而TC水平分別降低了7.10%、20.73%（

P

＜0.05）和37.95%（

P

＜0.05）。已有研究表明，MYP能夠有效地降低HepG2細(xì)胞中的TG和TC水平，并調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。納米顆粒的包埋進(jìn)一步增強(qiáng)了這一效果，CS和GC涂層具有強(qiáng)大的黏附特性，可以增強(qiáng)與細(xì)胞表面負(fù)電荷的相互作用，而MYP-GC-NP中的GC通過引入半乳糖殘基，使得納米顆粒表面能夠特異性地與肝細(xì)胞表面的ASGPR結(jié)合。這種受體介導(dǎo)的靶向機(jī)制促進(jìn)了MYP-GC-NP對HepG2細(xì)胞的識別與攝取，從而使其在降脂效果方面優(yōu)于MYP-CS-NP和游離MYP。

結(jié) 論

本研究從紅曲米粉中提取純化得到MYP。隨后，通過EDC/NHS催化反應(yīng)成功合成了GC，其半乳糖基取代度為58%，并采用反溶劑沉淀法，以玉米醇溶蛋白為載體，結(jié)合GC包覆，成功制備納米顆粒MYP-GC-NP。所得納米顆粒具有良好的分散性（PDI＝0.25±0.01）和較小的平均粒徑（（167.00±0.60）nm），并能有效提升肝細(xì)胞的攝取。在OA/PA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞模型中，MYP-GC-NP顯著減少了細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累，并降低了TG和TC含量。綜上，本研究通過納米遞送系統(tǒng)提高了MYP的生物利用度，并為脂質(zhì)沉積的干預(yù)提供了理論依據(jù)。

作者簡介

第一作者：

林楊 副教授

浙江工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院

林楊，女，工學(xué)博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，入選浙江工業(yè)大學(xué)“青年英才”。

學(xué)習(xí)&工作經(jīng)歷：

(1) 2020-7 至今, 浙江工業(yè)大學(xué), 食品學(xué)科, 講師、副教授

(2) 2018-8 至2020-3, 美國田納西大學(xué), 食品科學(xué)系, 聯(lián)合培養(yǎng)

(3) 2014-9 至2020-6, 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué), 食品科學(xué)與工程專業(yè), 碩博連讀

研究方向：

農(nóng)林食品功能與營養(yǎng)健康方向。

科研成果：

近3年來在國內(nèi)、外期刊發(fā)表SCI/EI收錄論文10余篇。作為第一作者發(fā)表JCR1區(qū)論文10余篇，EI收錄論文1 篇。

本文《曲黃色素納米顆粒的制備及其對HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積的改善作用》來源于《食品科學(xué)》202年46卷第20期170-179頁，作者：。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250324-189。點(diǎn)擊下方閱讀原文即可查看文章相關(guān)信息。

實(shí)習(xí)編輯：梁雯菁；責(zé)任編輯：張睿梅。點(diǎn)擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網(wǎng)