甲萘醌-7（MK-7）是VK2的一種亞型，是一種由2-甲基-1,4-萘醌環(huán)和7 個異戊二烯單元組成的脂溶性維生素。它在預(yù)防和治療許多常見疾病方面具有重要的生理功能，如心血管疾病、阿爾茨海默病、糖尿病和骨質(zhì)疏松癥等。目前，MK-7的微生物合成主要集中在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌（

Bacillus subtilis

）、蠟樣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌。

在先前的實驗中，通過敲除

SinR

基因構(gòu)建了工程菌株BS168-Δ

SinR

SinR

基因是枯草芽孢桿菌生物膜形成的關(guān)鍵抑制基因，該基因缺失使得工程菌株在靜置發(fā)酵下生成了大量聚集在培養(yǎng)基表面的生物膜。有研究表明，生物膜的形成可以促進MK-7的生物合成。細胞膜的有限容量本質(zhì)上決定了MK-7的最大產(chǎn)量。同時，當細胞內(nèi)MK-7的不斷積累會對細胞造成毒性，從而引起合成途徑的負反饋抑制，進而限制了MK-7的合成。因此，如果能促進MK-7的胞外分泌，就可以刺激胞內(nèi)MK-7的持續(xù)產(chǎn)生，MK-7的總產(chǎn)量將大大提高。近年來，表面活性劑已被廣泛應(yīng)用于提高各種代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。表面活性劑分子具有類似于磷脂分子的兩親性，由于分子之間的相互作用力而分布到膜中，當足夠數(shù)量的表面活性劑分子在細胞膜中聚集形成膠束時，它們會溶解磷脂分子，從而增加細胞膜的滲透性。因此，認為細胞膜的滲透性可能是影響MK-7分泌的關(guān)鍵因素之一，從滲透性的角度出發(fā)嘗試通過表面活性劑介導(dǎo)細胞膜滲透化的方法，探究其對MK-7產(chǎn)量的影響。

安徽工程大學生物與食品工程學院的陶偉、劉艷*，安徽安科余良卿藥業(yè)有限公司的劉海兵等以BS168-Δ

SinR

為起始菌株，篩選了可能提高工程菌株MK-7產(chǎn)量的表面活性劑，并對其進行濃度梯度優(yōu)化。通過掃描電鏡的觀察和流式細胞儀、熒光顯微鏡的檢測，進一步了解膜透化對細胞形態(tài)和細胞膜滲透性所產(chǎn)生的影響，并利用RNA-seq深入分析膜透化對提高MK-7產(chǎn)量相關(guān)基因的影響，以期為MK-7的工業(yè)化生產(chǎn)和表面活性劑介導(dǎo)的生物制造提供理論依據(jù)，也為功能性食品的開發(fā)奠定堅實的基礎(chǔ)。

1 表面活性劑的篩選與優(yōu)化

測定不同表面活性劑對菌株的生物膜量和MK-7產(chǎn)量的影響。陽離子表面活性劑CTAB和陰離子表面活性劑SDS對菌株具有強烈的毒性。添加0.5% CTAB或SDS時，細胞失去活性，生物膜形成被完全抑制（圖1A），發(fā)酵液中生物膜和MK-7均未檢測到（圖1B、C）。這可能是由于高濃度CTAB和SDS嚴重破壞了細胞膜完整性，引起細胞內(nèi)容物（如離子、蛋白質(zhì)和核酸）泄漏，并干擾細胞膜上蛋白質(zhì)和酶的正常功能，最終導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)和代謝功能的崩潰。兩性離子表面活性劑Betaine在溶液中呈陽離子和陰離子兩種狀態(tài)，其具有非極性固體表面單層的吸附能力，從而增強了菌株對營養(yǎng)物質(zhì)的吸附。添加0.5% Betaine促進了生物膜的形成和生物膜量的增長，但MK-7產(chǎn)量并未提高。

Tween-80和Brij-58是非離子表面活性劑，添加0.5% Tween-80的生物膜呈灰色顆粒狀聚集體，添加0.5% Brij-58的生物膜呈深紅色蚯蚓狀隆起，并伴有大量褶皺（圖1A）。有研究表明，褶皺的形成促進了膜內(nèi)通道網(wǎng)絡(luò)的連接，降低了液體流動的阻力，使通道內(nèi)壓力低于外部大氣壓，這種壓力梯度可以促進營養(yǎng)物質(zhì)流過生物膜，最終影響次級代謝產(chǎn)物的合成。在該實驗中，Brij-58顯著提高了生物膜量和MK-7產(chǎn)量。添加0.5% Brij-58的菌株，其生物膜量達到（131.07±2.27）g/L，較對照組提高44.78%；MK-7總產(chǎn)量達到（82.85±1.08）mg/L，較對照組提高45.97%，其中胞外MK-7產(chǎn)量達到（60.09±1.6）mg/L，較對照組提高291.98%。這些結(jié)果表明，合適的表面活性劑可有效提高菌株的MK-7產(chǎn)量。同時，發(fā)現(xiàn)Brij-58導(dǎo)致的細胞膜滲透化顯著促進了MK-7的胞外分泌。

鑒于Brij-58對菌株胞外分泌MK-7有顯著的影響，對其添加量優(yōu)化。在添加0.7% Brij-58的條件下，菌株的MK-7總產(chǎn)量達到（97.59±1.30）mg/L，較對照組提高71.95%，其中胞外MK-7產(chǎn)量達到（66.27±0.78）mg/L，較對照組提高332.29%（圖1D）。該添加量下，菌株生長在前期受到了一定的抑制，但在72 h后逐漸恢復(fù)（圖1E），144 h生物量略高于對照組。當Brij-58添加量提高至0.9%和1.1%時，菌株生長受到明顯抑制，144 h生物量較對照組分別下降了16.5%和19.5%，進而導(dǎo)致MK-7總產(chǎn)量下降。上述結(jié)果表明，0.7%為Brij-58最優(yōu)添加量，可在維持菌株生長的同時最大化MK-7的產(chǎn)量。

2 膜透化對生物膜和MK-7產(chǎn)量的影響

為深入了解Brij-58介導(dǎo)的膜透化所產(chǎn)生的影響，觀察生物膜形成的過程，并檢測生物膜量和MK-7產(chǎn)量的變化。對照組菌株在48 h已形成大量生物膜（圖2A），其生物膜量隨時間逐漸積累，于96 h達到最大值（圖2B），然而在144 h生物膜出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，生物膜量降低至（90.53±0.90）g/L。Brij-58組（添加0.3% Brij-58和0.7% Brij-58）菌株，其生物膜形成受到明顯抑制，分別在96 h和120 h才完全形成。這可能是由于Brij-58會導(dǎo)致細胞膜結(jié)構(gòu)損傷，進而抑制菌株前期的生長繁殖（生物量積累緩慢），最終延緩了生物膜的形成。在高濃度Brij-58條件下，48 h前，由于菌株生長受抑制，生物膜量增長緩慢；48 h后，生物膜量則顯著增加，最終在144 h時，0.3% Brij-58和0.7% Brij-58組的生物膜量分別達到（121.73±1.60）g/L和（130.85±1.14）g/L。

測定菌株在48、96 h和144 h 3 個時間點的MK-7產(chǎn)量（圖2C）。在高濃度Brij-58條件下，發(fā)酵前期菌株MK-7的分泌受到限制，但發(fā)酵后期轉(zhuǎn)而促進MK-7的分泌，尤其是胞外MK-7的分泌，使得Brij-58組的胞外MK-7產(chǎn)量顯著高于對照組。值得注意的是，96 h的MK-7產(chǎn)量與生物膜量的變化趨勢并不一致，這表明生物膜僅是影響MK-7產(chǎn)量的諸多因素之一。雖然高濃度Brij-58會抑制菌株前期的生長繁殖，進而限制EPS和MK-7的分泌，但隨著菌株生物量逐漸積累，Brij-58導(dǎo)致的細胞膜滲透化作用開始顯現(xiàn)，不僅促進了營養(yǎng)物質(zhì)向胞內(nèi)的運輸，也顯著增強了EPS和MK-7等代謝產(chǎn)物向胞外的分泌。

3 膜透化對細胞形態(tài)的影響

通過掃描電鏡觀察膜透化對菌株細胞形態(tài)的影響。如圖3所示，未添加Brij-58的菌株，細胞呈典型的長桿狀（形態(tài)飽滿），表面光滑、完整、無缺損痕跡（圖3A1）。添加0.3% Brij-58的菌株，細胞表面出現(xiàn)皺紋、凹陷，極少數(shù)細胞出現(xiàn)裂紋（圖3A2），表明該添加量條件下膜透化開始影響細胞膜的流動性，但尚未損傷細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。添加0.7% Brij-58的菌株，細胞形態(tài)顯著改變，表面粗糙化并附著大量活性膠束（圖3A3）。此現(xiàn)象源于Brij-58和磷脂雙分子層相互溶解形成的混合膠束，其可以改變細胞膜結(jié)構(gòu)，有利于營養(yǎng)物質(zhì)進入胞內(nèi)以及代謝產(chǎn)物分泌到胞外。

同時，將0.7% Brij-58處理6 d的菌株轉(zhuǎn)移至無Brij-58體系進行3 代恢復(fù)實驗。在無Brij-58的LB培養(yǎng)基中連續(xù)傳代3 代，其生長曲線與對照組（未用Brij-58處理的菌株）的生長趨勢基本一致（圖3B）；在無Brij-58的發(fā)酵培養(yǎng)基中，連續(xù)發(fā)酵3 代的MK-7總產(chǎn)量穩(wěn)定維持在56～60 mg/L（圖3C）；掃描電鏡顯示，細胞表面活性膠束完全消失，恢復(fù)光滑、完整的特征（圖3D）。這些結(jié)果表明Brij-58介導(dǎo)的膜透化具有可逆性，且不影響菌株的長期代謝活性和遺傳穩(wěn)定性。

4 膜透化對細胞滲透膜的影響

PI是一種帶正電荷的核酸結(jié)合探針，廣泛應(yīng)用于細胞膜滲透性評估，其能夠擴散到死細胞中與核酸結(jié)合以產(chǎn)生紅色熒光。然而，進一步研究發(fā)現(xiàn)，并非所有被PI染色的細胞都是死細胞，細胞膜受損的細胞也能夠被染色并檢測到。因此，通過檢測PI結(jié)合細胞的熒光強度評估膜透化對細胞膜滲透性的影響。

如圖4所示，將未染色的細胞設(shè)為陰性對照（圖4A1），將100 ℃滅活并染色的細胞設(shè)為陽性對照（圖4A2）。將PI陽性細胞區(qū)域設(shè)為門，門內(nèi)細胞比例越高，表明死亡或膜受損的細胞比例越大。由于自發(fā)性細胞凋亡，對照組（未添加Brij-58）細胞的PI陽性比例達到11.94%（圖4A3），在Brij-58組（添加0.3% Brij-58和0.7% Brij-58）中，細胞的PI陽性比例隨添加量增加而升高，從19.03%增至28.40%（圖4A4、A5）。熒光顯微鏡觀察結(jié)果（圖4B）顯示，各組熒光強度的差異表明Brij-58對細胞膜的損傷呈濃度依賴性，這與流式細胞儀結(jié)果一致。這些結(jié)果證實了膜透化顯著增加了細胞膜滲透性。而膜滲透性的增加有助于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝產(chǎn)物的分泌，這與Yi Yunxin等的研究結(jié)果一致，也與其他研究中通過表面活性劑增加膜滲透性以促進代謝產(chǎn)物分泌的作用機制相符。

5 膜透化對提高MK-7產(chǎn)量相關(guān)基因的影響

為探究Brij-58介導(dǎo)的膜透化對提高MK-7產(chǎn)量相關(guān)基因的影響，對樣品進行RNA-seq轉(zhuǎn)錄組測序。以錯誤發(fā)現(xiàn)率≤0.05、|log2差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）|≥1為條件篩選樣品間的DEGs。根據(jù)火山圖顯示（圖5A），共篩選出1 582 個顯著DEGs，其中顯著上調(diào)和下調(diào)基因分別為846 個和736 個。將篩選得到的DEGs注釋到GO數(shù)據(jù)庫中并映射到不同的途徑。GO功能富集分析（圖5B）顯示，大部分DEGs顯著富集于細胞過程、代謝過程和催化活性。KEGG通路富集分析（圖5C）顯示，共有16 條通路顯著富集，主要包括ABC轉(zhuǎn)運蛋白、磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)、碳代謝、氧化磷酸化和群體感應(yīng)等。其中，ABC轉(zhuǎn)運蛋白和磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)兩條通路與膜轉(zhuǎn)運相關(guān)，這可能與MK-7分泌有聯(lián)系。

5.1 MK-7生物合成相關(guān)的差異基因表達

如圖6所示，枯草芽孢桿菌的MK-7生物合成通路可分為4 個模塊，即甘油代謝途徑、莽草酸（SA）途徑、2-

C

-甲基-

D

-赤蘚醇-4-磷酸（MEP）途徑、MK-7途徑。在甘油代謝途徑中，胞外的甘油需經(jīng)甘油通道蛋白（由

GlpF

基因編碼）攝取進入胞內(nèi)。進入胞內(nèi)的甘油依次經(jīng)甘油激酶（由

GlpK

基因編碼）和甘油-3-磷酸脫氫酶（由

GlpD

基因編碼）催化，生成磷酸二羥丙酮（DHAP），隨后進入糖酵解途徑。在添加Brij-58的條件下，

GlpF

GlpK

GlpD

分別上調(diào)了0.46、0.11 倍和0.08 倍。已有研究發(fā)現(xiàn)，

GlpK

GlpD

的過表達可加快菌株對甘油的消耗，導(dǎo)致MK-7產(chǎn)量提高10%。這些結(jié)果表明，Brij-58介導(dǎo)的膜透化增加了菌株對底物甘油的攝取和消耗，促進了DHAP的合成。這有利于更多的甘油醛-3-磷酸（glyceraldehyde-3-phosphate，G3P）流向SA途徑和MEP途徑，從而為MK-7合成提供前體物質(zhì)。

SA途徑為MK-7的主鏈提供了重要前體物質(zhì)分支酸（chorismate，CHA），CHA也是芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸）以及多種芳香族化合物的重要前體物質(zhì)。在SA途徑中，

AroA

AroB

AroC

AroD

分別上調(diào)了1.28、0.32、0.45 倍和0.21 倍。這些基因的上調(diào)極大地促進了赤蘚糖-4-磷酸（E4P）和磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）向CHA的轉(zhuǎn)化，從而導(dǎo)致CHA的迅速積累，使得流向MK-7途徑的碳通量增多。而

AroK

AroE

均下調(diào)，這可能與CHA積累導(dǎo)致的芳香族氨基酸濃度升高有關(guān)。已有研究表明，高濃度的芳香族氨基酸會通過反饋抑制機制調(diào)控SA途徑相關(guān)基因的表達。

MEP途徑是合成異戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）的關(guān)鍵途徑，這兩種化合物在庚烯基焦磷酸合酶（由

HepS

HepT

基因編碼）催化下，縮合形成MK-7側(cè)鏈的重要前體物質(zhì)七異戊二烯基焦磷酸（HepPP）。在MEP途徑中，1-脫氧-

D

-木酮糖-5-磷酸合酶（由

Dxs

基因編碼）和1-脫氧-

D

-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶（由

Dxr

基因編碼）被認為是這一途徑的限速酶，其分別上調(diào)了0.50 倍和1.35 倍。該結(jié)果與先前的研究一致，

Dxs

Dxr

共同過表達可使MK-7產(chǎn)量提高4.6 倍。此外，該途徑中其余酶的基因表達均不同程度的上調(diào)。這些變化均有利于IPP和DMAPP的積累，從而為MK-7異戊二烯側(cè)鏈的合成提供更多的前體物質(zhì)。

MK-7途徑是MK-7生物合成通路的最終步驟，該途徑將SA途徑提供的CHA和MEP途徑提供的HepPP，通過多種酶的協(xié)同作用轉(zhuǎn)化為MK-7。在MK-7途徑中，9 種酶的基因表達均發(fā)生不同程度的變化，其中

MenD

MenA

MenG

分別上調(diào)了1.54、0.60 倍和1.26 倍。有研究表明，在枯草芽孢桿菌中過表達MenD可使MK-7產(chǎn)量提高80%，這證明了

MenD

是MK-7途徑中的限速酶。Huang Wei等發(fā)現(xiàn)，在枯草芽孢桿菌中過表達

MenA

可使 VK 2 產(chǎn)量 提高89%，這進一步支持了

MenA

在MK-7途徑中的重要性。此外，在腦膜敗血伊麗莎白菌中

MenG/UbiE

的過表達也可使MK產(chǎn)量提高1.41 倍。

5.2 孢子形成和抗氧化防御系統(tǒng)相關(guān)的差異基因表達

枯草芽孢桿菌的營養(yǎng)細胞會在營養(yǎng)缺乏、溫度過高或過低、pH值不適宜等惡劣環(huán)境下分化為孢子。有研究表明，孢子的形成會減緩或停止MK-7的生物合成。如圖7所示，在孢子形成的磷酸化系統(tǒng)中，

Spo0A

是孢子形成的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可通過磷酸化促進孢子的形成，其與其余孢子形成相關(guān)的基因表達水平均下調(diào)，這可能是由于Brij-58導(dǎo)致菌株前期的生長繁殖受到抑制，使得發(fā)酵周期延長，進而延緩了孢子形成的時間。該結(jié)果與圖2趨勢一致。

在枯草芽孢桿菌的生長繁殖過程中，活性氧（ROS）的產(chǎn)生不可避免。ROS水平越高，對細胞造成的損傷越大，這可能間接影響MK-7的積累。有研究發(fā)現(xiàn)，表面活性劑CTAB的添加會導(dǎo)致ROS的積累，從而損傷細胞膜結(jié)構(gòu)、增加細胞膜滲透性，最終使甘露肽產(chǎn)量提高了98.6%。此外，已有研究證實，ROS的積累會導(dǎo)致抗氧化防御系統(tǒng)相關(guān)基因的上調(diào)。為進一步探究ROS對MK-7產(chǎn)量的影響，對抗氧化防御系統(tǒng)相關(guān)基因的表達水平進行分析。如圖7所示，編碼超氧化物歧化酶（主要負責清除細胞內(nèi)的超氧化物自由基）的基因

SodC

SodF

分別上調(diào)了0.58 倍和2.24 倍。編碼烷基過氧化氫還原酶系統(tǒng)（主要負責清除細胞內(nèi)的過氧化氫）的基因

AhpA

AhpC

AhpF

分別上調(diào)了0.49、0.15 倍和0.18 倍。這些基因的上調(diào)表明，Brij-58的添加導(dǎo)致了ROS的大量積累，從而誘導(dǎo)膜結(jié)構(gòu)損傷及膜滲透性增加。該結(jié)果與圖3和圖4趨勢一致。

結(jié)論

本研究以工程菌株BS168-Δ

SinR

作為起始菌株，重點探究了表面活性劑介導(dǎo)的膜透化對工程菌株MK-7產(chǎn)量的影響。研究結(jié)果表明，添加表面活性劑可有效提高菌株的MK-7產(chǎn)量。通過對多種表面活性劑進行篩選和添加量梯度優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)添加0.7% Brij-58可顯著提高MK-7產(chǎn)量，使得MK-7總產(chǎn)量較對照菌株提高了71.95%，其中胞外MK-7產(chǎn)量提高了332.29%。通過觀察生物膜形成并檢測生物膜量和MK-7產(chǎn)量變化，發(fā)現(xiàn)Brij-58介導(dǎo)的膜透化在前期會抑制菌株的生長繁殖，從而限制代謝產(chǎn)物的分泌，但在后期有效促進了MK-7的胞外分泌，并緩解了胞內(nèi)MK-7積累引起的反饋抑制。此外，掃描電鏡、流式細胞儀和熒光顯微鏡的結(jié)果進一步證實了膜透化與MK-7產(chǎn)量提高之間的內(nèi)在聯(lián)系。同時，通過實驗證明了Brij-58介導(dǎo)的膜透化具有可逆性，且不影響菌株的長期代謝活性和遺傳穩(wěn)定性。最后利用RNA-seq深入分析膜透化對提高MK-7產(chǎn)量相關(guān)基因的影響（直接或間接），結(jié)果顯示，大多數(shù)與MK-7生物合成和抗氧化防御系統(tǒng)相關(guān)的基因表達水平顯著上調(diào)，而孢子形成相關(guān)的基因表達水平均下調(diào)。

綜上，本研究的結(jié)果為表面活性劑介導(dǎo)的膜透化提高MK-7產(chǎn)量的作用機制提供了理論依據(jù)，對推動MK-7可持續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。后續(xù)研究可進一步優(yōu)化代謝途徑中關(guān)鍵調(diào)控基因的表達，并探索更高效的發(fā)酵策略，以實現(xiàn)MK-7產(chǎn)量的進一步提高。

通信作者：

劉 艷 教授

安徽工程大學生物與食品工程學院 合成生物學與生物制造團隊帶頭人

教授、博士生導(dǎo)師、安徽省領(lǐng)軍人才特聘教授，安徽工程大學合成生物學與微生物制造團隊帶頭人。中科院合肥物質(zhì)科學院生物物理學博士，美國弗吉尼亞聯(lián)邦大學訪問學者，安徽省生物工程學會常務(wù)理事。先后主持國家自然科學基金（面上、青年）3 項，安徽省自然科學基金、省高校杰出青年基金等省部級項目10余項。發(fā)表高水平SCI論文30余篇，授權(quán)國家發(fā)明專利12 件（其中國際專利2 件）。主要從事發(fā)酵過程中群體微生物結(jié)構(gòu)與功能、微生物及其代謝機理、微生物新酶及其分子改造等研究工作，從基因組學、蛋白組學和代謝組學的水平上，解析微生物發(fā)酵機制、探索微生物酶蛋白的結(jié)構(gòu)與催化功能的相互關(guān)系，提升和改造傳統(tǒng)發(fā)酵工藝，采用合成生物學技術(shù)發(fā)掘和延展新的生物制造過程，滿足工業(yè)生物制造的需求。

本文《表面活性劑介導(dǎo)的膜透化對枯草芽孢桿菌工程菌產(chǎn)甲萘醌-7的影響》來源于《食品科學》2025年46卷第19期98-106頁，作者：陶偉，劉海兵，郭明雨，劉永圓，Elvis Kwame ADINKRA，李瑜琪，馬月欣，陳 宇，吳傳超，劉艷*。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250402-012。點擊下方閱讀原文即可查看文章相關(guān)信息。

實習編輯：農(nóng)夢琪；責任編輯：張睿梅。點擊下方 閱讀原文 即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網(wǎng)