天麻（Gastrodia elata）為蘭科天麻屬多年生寄生草本植物，又名神草、赤箭、定風(fēng)草、明天麻、水洋芋等。研究表明，天麻富含多酚、多糖、氨基酸、甾體和苷類化合物等多種生物活性成分，具有抗氧化、降血糖、抗炎、神經(jīng)保護(hù)等生物活性作用。

多酚是一類廣泛存在于植物中的次生代謝產(chǎn)物，其主要結(jié)構(gòu)特征為至少有一個(gè)苯環(huán)上連接一個(gè)或多個(gè)羥基，目前被報(bào)道的酚類結(jié)構(gòu)已超過8 000 種。植物多酚因其特殊的酚羥基結(jié)構(gòu)，具有多種生理功能，如抗氧化、抗炎、抗癌、抑菌、降血糖等。多酚也是天麻的活性成分，但目前對其研究較少。

西南林業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院的董仕豪、郭磊*，昭通學(xué)院的申開澤*等采用大孔吸附樹脂純化天麻多酚，再通過UPLC-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS）聯(lián)用技術(shù)鑒定其多酚組成，進(jìn)一步采用酶動(dòng)力學(xué)分析天麻多酚對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性及動(dòng)力學(xué)特征，旨在為天麻多酚的化學(xué)組成及其降血糖作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)，并為天麻多酚資源的開發(fā)利用提供參考。

01

天麻多酚的組成分析

天麻多酚提取物在正負(fù)離子模式下的色譜峰譜圖如圖1所示。根據(jù)保留時(shí)間、一級(jí)碎片和二級(jí)碎片離子信息對化合物進(jìn)行定性分析，經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)品庫、文獻(xiàn)和人類代謝組數(shù)據(jù)庫比對，共鑒定出30 種多酚類化合物，其碎片信息和初步鑒定的單體組成和結(jié)構(gòu)式見表1、圖2。天麻多酚中含量相對較高的化合物主要包括千層紙素甲-7-O-葡萄糖醛酸、櫻花素和根皮素等?；衔?在負(fù)離子模式下的保留時(shí)間為7.18 min，有母離子m/z 459.09 [M—H]—，二級(jí)質(zhì)譜產(chǎn)生m/z 283.06特征碎片離子，可知碎片為丟失一分子葡萄糖醛酸。與陳秋竹等鑒定出的千層紙素甲-7-O-葡萄糖醛酸碎片一致，因此確定化合物1為千層紙素甲-7-O-葡萄糖醛酸?；衔?在負(fù)離子模式下的保留時(shí)間為8.78 min，在m/z 285.08處有[M—H]—母離子峰，櫻花素的分子離子為m/z 303.24 [M＋H]＋，但在負(fù)離子模式下可能出現(xiàn)m/z 285.08，表明該分子經(jīng)過去質(zhì)子的過程形成了負(fù)離子。碎片離子m/z 165.02是通過苯環(huán)裂解后形成的碎片離子，與櫻花素的解離模式一致。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道基本一致，故鑒定該化合物為櫻花素。化合物3在正離子模式下的保留時(shí)間為7.84 min，有母離子m/z 179.03 [M＋H]＋，二級(jí)質(zhì)譜產(chǎn)生m/z 107.04 [M＋H—C8H8O4]＋特征碎片離子，與數(shù)據(jù)庫中根皮素標(biāo)準(zhǔn)品吻合，因此確定化合物3為根皮素?；衔?在m/z 481.10有[M＋H]＋母離子峰，由此可以推斷為楊梅素，斷裂產(chǎn)生了一個(gè)m/z 319.06的二級(jí)碎片離子片段，其苷元為半乳糖苷（m/z 162），楊梅素連接著苷元，因此推斷化合物4為楊梅素-3-O-半乳糖苷。化合物5在正離子模式下的保留時(shí)間為9.15 min，有母離子m/z 257.12 [M＋H]＋，產(chǎn)生的二級(jí)碎片離子有m/z 133.06，碎片離子為母離子失去一分子甲基基團(tuán)得到的碎片峰，結(jié)合裂解規(guī)律與吳建雄等對紫檀芪的鑒定結(jié)果一致，因此確定化合物5為紫檀芪。化合物6在正離子模式下的保留時(shí)間為1.47 min，有母離子m/z 127.04 [M＋H]＋，苯環(huán)裂解產(chǎn)生一個(gè)帶有氧的苯基離子碎片m/z 139.04，其質(zhì)譜信息與張佳等鑒定的間苯三酚結(jié)果相符，因此確定化合物6為間苯三酚?；衔?在正離子模式下的保留時(shí)間為12.52 min，有母離子m/z 255.07 [M＋H]＋，二級(jí)質(zhì)譜產(chǎn)生m/z 153.00特征碎片離子與布比阿加爾·哈依拉提等鑒定出的白楊素碎片一致，因此確定化合物7為白楊素?；衔?在正離子模式下的保留時(shí)間為8.80 min，有母離子m/z 153.05[M＋H]＋，裂解丟失一分子乙?；鶊F(tuán)產(chǎn)生碎片離子m/z 107.05，其質(zhì)譜信息與2’,4’-二羥基苯乙酮標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)據(jù)相符合，因此確定化合物8為2’,4’-二羥基苯乙酮。化合物9在正離子模式下的保留時(shí)間為8.26 min，有母離子m/z 275.13 [M＋H]＋，二級(jí)質(zhì)譜產(chǎn)生m/z 151.08碎片離子，與數(shù)據(jù)庫中石斛酚標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)吻合，因此確定化合物9為石斛酚?；衔?0在正離子模式下產(chǎn)生母離子m/z 257.10，碎片離子為m/z 137.02 [M＋H—C8H8O]＋，與防己茯苓湯中甘草素的質(zhì)譜信息相符，因此推測化合物10為甘草素。化合物11在負(fù)離子模式下的保留時(shí)間為10.82 min，有母離子m/z 295.05 [M—H]—，二級(jí)質(zhì)譜產(chǎn)生m/z 179.03特征碎片離子，與林結(jié)玲等鑒定出的咖啡酸基蘋果酸碎片一致，因此確定化合物11為咖啡酸基蘋果酸?；衔?2在負(fù)離子模式下的保留時(shí)間為8.96 min，有母離子m/z 269.05 [M—H]—，脫去一分子H2O后通過逆狄爾斯-阿德爾反應(yīng)（retro Diels-Alder reaction，RDA）裂解產(chǎn)生碎片離子m/z 162.84，與陳寧等鑒定出的黃芩素碎片一致，因此確定化合物12為黃芩素。化合物13在負(fù)離子模式下顯示母離子m/z 423.18 [M—H]—，碎片離子為m/z 261.15 [M—H—C9H6O3]—。該化合物在A環(huán)8位連接了1 個(gè)薰衣草烷基，這與文獻(xiàn)[29]報(bào)道的脫薰衣草烷基二氫黃酮類化合物碎片途徑一致，因此推測化合物13為槐黃烷酮G?；衔?4在正離子模式下的保留時(shí)間為8.06 min，有母離子m/z 243.10 [M＋H]＋，產(chǎn)生的二級(jí)碎片離子m/z 149.06，通過比對文獻(xiàn)[30]，化學(xué)物14被鑒定為松茋。化合物15的保留時(shí)間為11.67 min，在正離子模式下母離子為m/z 481.10 [M＋H]＋，主要離子碎片為m/z 319.04，結(jié)合文獻(xiàn)[31]和數(shù)據(jù)庫確定化合物15為櫟草亭-7-O-葡萄糖苷?；衔?6在正離子模式下產(chǎn)生的保留時(shí)間為8.25 min，有母離子m/z 243.10 [M＋H]＋，產(chǎn)生二級(jí)碎片m/z 135.04，與焦春偉等鑒定出白藜蘆醇-4’-甲醚碎片一致，因此確定化合物16為白藜蘆醇-4’-甲醚?；衔?7的保留時(shí)間為12.45 min，在正離子模式下母離子峰為m/z 229 [M＋H]＋，同時(shí)主要碎片離子為m/z 135，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[33]確定化合物17為白藜蘆醇?；衔?8在正離子模式下的保留時(shí)間為1.78 min，有母離子m/z 291.1 [M＋H]＋，環(huán)內(nèi)裂解產(chǎn)生碎片離子m/z 139.04，其質(zhì)譜信息與兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)據(jù)相符合，因此確定化合物18為兒茶素?；衔?9在負(fù)離子模式下的保留時(shí)間為11.01 min，有母離子m/z 283.06 [M—H]—，二級(jí)質(zhì)譜產(chǎn)生m/z 162.84碎片離子，結(jié)合文獻(xiàn)[35]確定化合物19為高良姜素-3-甲醚。化合物20在負(fù)離子模式下的保留時(shí)間為10.82 min，有母離子m/z 295.05 [M—H]—，碎片離子m/z 179.03，與孫晶等鑒定出的龍血素C碎片信息一致，因此確定化合物20為龍血素C?；衔?1在負(fù)離子模式下母離子峰為m/z 287.06 [M—H]—，二級(jí)質(zhì)譜產(chǎn)生m/z 153.01碎片離子，結(jié)合文獻(xiàn)[37]確定化合物21為去甲丁香色原酮?；衔?2在正離子模式下的保留時(shí)間為12.52 min，有母離子m/z 255.07 [M＋H]＋，二級(jí)質(zhì)譜產(chǎn)生m/z 153.00特征碎片離子，通過比對參考文獻(xiàn)[38]確定化學(xué)物22為8-羥基芹菜素?；衔?3的特征離子m/z 285.03，與柏?zé)o瑕鑒定的山柰酚-3-O-半乳糖苷結(jié)果一致，因此推測化合物23為山柰酚-3-O-半乳糖苷?；衔?4在正離子模式下產(chǎn)生母離子m/z 317.07 [M＋H]＋，二級(jí)碎片離子m/z 302.04，與丹參提取物中澤蘭黃酮的質(zhì)譜信息相符，因此推測化合物24為澤蘭黃酮?；衔?5在正離子模式下的保留時(shí)間為12.25 min，有母離子m/z 579.17 [M＋H]＋，二級(jí)質(zhì)譜產(chǎn)生m/z 271.07特征碎片離子，與姜浩等鑒定出的野漆樹苷碎片信息一致，因此確定化合物25為野漆樹苷。化合物26在m/z 287.06處有[M＋H]＋母離子峰、碎片離子m/z 153.02，這與雷舒雯對2’-羥基金雀異黃素的鑒定結(jié)果一致，因此推測化合物26為2’-羥基金雀異黃素?；衔?7在正離子模式下的保留時(shí)間為9.27 min，有母離子m/z 273.11 [M＋H]＋，二級(jí)質(zhì)譜產(chǎn)生m/z 137.06特征碎片離子，與張欣珂等鑒定出的3’-羥基紫檀芪碎片信息一致，因此確定化合物27為3’-羥基紫檀芪?；衔?8在m/z 285處有[M—H]—母離子峰、碎片離子m/z 151，這與周德勇等對山柰酚的鑒定結(jié)果一致，因此推測化合物28為山柰酚?；衔?9在正離子模式下的保留時(shí)間為8.50 min，有母離子m/z 273.08[M＋H]＋，失去1 個(gè)CO后通過RDA裂解得二級(jí)碎片離子m/z 153.02，這與韓碩等對柚皮素的鑒定結(jié)果一致，因此推測化合物29為柚皮素?；衔?0在負(fù)離子模式下的保留時(shí)間為6.35 min，有母離子m/z 179.03 [M—H]—，產(chǎn)生的二級(jí)碎片離子為m/z 135.05，其為母離子失去1 個(gè)CO2得到的[M—CO2—H]—碎片峰，這與李進(jìn)發(fā)對咖啡酸的鑒定結(jié)果一致，因此推測化合物30為咖啡酸。

綜上所述，利用UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS技術(shù)在天麻多酚提取物中共鑒定出30 種多酚類化合物，包括黃酮類化合物23 種（千層紙素甲-7-O-葡萄糖醛酸、櫻花素、根皮素、楊梅素-3-O-半乳糖苷、白楊素、甘草素、黃芩素、槐黃烷酮G、松茋、櫟草亭-7-O-葡萄糖苷、白藜蘆醇-4’-甲醚、白藜蘆醇、兒茶素、高良姜素-3-甲醚、龍血素C、去甲丁香色原酮、8-羥基芹菜素、山柰酚-3-O-半乳糖苷、澤蘭黃酮、野漆樹苷、2’-羥基金雀異黃素、山柰酚、柚皮素）、酚酸類化合物2 種（咖啡酸基蘋果酸、咖啡酸）和酚類化合物5 種（紫檀芪、間苯三酚、2’,4’-二羥基苯乙酮、石斛酚、3’-羥基紫檀芪）。部分化合物已被證明具有較好的降血糖活性，如白楊素可顯著升高糖尿病大鼠體質(zhì)量，降低大鼠血糖水平，同時(shí)可以升高糖尿病大鼠肝臟磷脂酰肌醇3-激酶、蛋白激酶B（Akt）及p-糖原合酶激酶3β（GSK-3β）的表達(dá)水平，預(yù)防治療大鼠糖尿病。兒茶素通過激活A(yù)MP依賴的蛋白激酶（AMPK）信號(hào)通路促進(jìn)葡萄糖的攝取和利用，提高細(xì)胞對胰島素的響應(yīng)，同時(shí)通過調(diào)節(jié)脂肪代謝和減少脂肪組織中的炎癥反應(yīng)降低胰島素抵抗，改善胰島素敏感性，從而降低血糖水平。山柰酚作用于Akt PH結(jié)構(gòu)域激活A(yù)kt1，進(jìn)而激活A(yù)kt1/GSK-3β通路，并作用于腫瘤蛋白p53靶點(diǎn)調(diào)節(jié)糖酵解過程，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、改善胰島素抵抗的作用，從而達(dá)到降血糖的效果。同時(shí)，本研究中天麻多酚粗提物經(jīng)XDA-7型大孔吸附樹脂分離純化后的純度由24.60%提高到62.11%，天麻多酚中的活性成分含量被提高，因此天麻多酚可作為潛在降低血糖的功能性成分。

02

天麻多酚對淀粉消化酶的抑制作用

α -淀粉酶和 α -葡萄糖苷酶是碳水化合物消化的關(guān)鍵酶，直接影響血糖水平， α -淀粉酶主要通過隨機(jī)水解淀粉中的 α -1,4糖苷鍵生成麥芽糖和葡萄糖， α -葡萄糖苷酶則通過順序水解低聚糖釋放出葡萄糖，從而導(dǎo)致血糖水平上升 。在天然產(chǎn)物降糖機(jī)制研究中同時(shí)評估這2 種酶的抑制活性，既能闡明其多靶點(diǎn)作用特征，也可為開發(fā)低副作用降糖制劑提供理論依據(jù) 。

2.1對

如圖3A所示，天麻多酚對α-淀粉酶的抑制率隨著其質(zhì)量濃度的增加而增加，表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。在相同質(zhì)量濃度下，天麻多酚的抑制率略低于阿卡波糖，但當(dāng)抑制劑質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)，二者抑制率差異并不顯著，分別為（91.31±4.35）%和（79.71±2.51）%。阿卡波糖和天麻多酚的IC50分別為（0.027±0.003）、（0.057±0.011）mg/mL。由此可知，天麻多酚對α-淀粉酶具有較好抑制效果，但不如阿卡波糖。因此，天麻多酚可作為潛在的α-淀粉酶抑制劑。

由圖3B可知，天麻多酚對α-淀粉酶的抑制呈現(xiàn)以下動(dòng)力學(xué)特征：雙倒數(shù)曲線交匯于第3象限，且隨抑制劑質(zhì)量濃度增加，最大反應(yīng)速率（vmax）和米氏常數(shù)（Km）同步降低。這與反競爭性-非競爭性混合抑制模式相符。通過Lineweaver-Burk方程參數(shù)分析，結(jié)合式（3）計(jì)算出天麻多酚對酶-底物復(fù)合物的解離常數(shù)（KIS＝0.116 0 mg/mL）顯著低于其對游離α-淀粉酶的解離常數(shù)（KI＝0.137 5 mg/mL）（表2和圖3C、D）。根據(jù)解離常數(shù)與結(jié)合強(qiáng)度的反比關(guān)系，可知天麻多酚更易與酶-底物復(fù)合物形成穩(wěn)定結(jié)合，這種選擇性結(jié)合機(jī)制可有效阻斷底物轉(zhuǎn)化過程，通過抑制淀粉向葡萄糖的轉(zhuǎn)化途徑實(shí)現(xiàn)降血糖效應(yīng)。

2.2 對

如圖4A所示，天麻多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制效應(yīng)呈現(xiàn)劑量依賴性增長，其抑制率隨天麻多酚質(zhì)量濃度升高呈現(xiàn)先顯著增強(qiáng)后趨于穩(wěn)定的非線性劑量效應(yīng)。在相同質(zhì)量濃度梯度下，阿卡波糖表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制活性，但隨質(zhì)量濃度的升高，二者的抑制效果差異呈收斂趨勢。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)，二者抑制率分別為（94.67±1.15）%和（77.33±2.31）%。阿卡波糖和天麻多酚的IC50分別為（0.018±0.001）、（0.189±0.017）mg/mL。綜上所述，天麻多酚對α-葡萄糖苷酶活性具有一定的體外抑制作用，但不如阿卡波糖，天麻多酚可作為潛在的α-葡萄糖苷酶抑制劑。

根據(jù)酶動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果可知，天麻多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制呈現(xiàn)以下動(dòng)力學(xué)特征：隨抑制劑質(zhì)量濃度梯度增加，Km顯著遞增而vmax逐漸下降，各質(zhì)量濃度的抑制直線相交于第2象限（圖4B），符合競爭性-非競爭性混合抑制的典型特征。天麻多酚抑制α-葡萄糖苷酶的Lineweaver-Burk方程見表3，通過Km/vmax與1/vmax對濃度的線性回歸分析獲得關(guān)鍵結(jié)合參數(shù)：天麻多酚與游離α-葡萄糖苷酶的解離常數(shù)（KI＝0.039 4 mg/mL）較其對酶-底物復(fù)合物的抑制常數(shù)（KIS＝10.040 7 mg/mL）低2 個(gè)數(shù)量級(jí)（圖4C、D）。這表明抑制劑優(yōu)先與游離酶構(gòu)象結(jié)合形成穩(wěn)定復(fù)合物，通過競爭性占據(jù)酶活性位點(diǎn)顯著削弱底物催化效率，進(jìn)而有效抑制淀粉類底物向葡萄糖的轉(zhuǎn)化過程，該分子作用機(jī)制為天麻多酚的降血糖功能提供了酶學(xué)層面的理論依據(jù)。

討論與結(jié)論

糖尿病是一種以血糖持續(xù)升高為特征的代謝性疾病，由胰島素分泌不足或胰島素作用受損引起。它是一種常見的慢性病，其中2型糖尿病是糖尿病的主要類型，占比約90%～95%。長期碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)的代謝失調(diào)會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的多個(gè)系統(tǒng)受損，從而引發(fā)腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)和心臟等組織器官出現(xiàn)慢性進(jìn)行性病變，最終可能導(dǎo)致這些器官功能下降甚至衰竭。當(dāng)前，治療和控制糖尿病的主要藥物包括磺脲類和奈列類、α-糖苷酶抑制劑以及鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白酶抑制劑、胰島素等。這些藥物在降低血糖和延緩疾病進(jìn)展方面具有顯著作用，但長期服用往往會(huì)引發(fā)腹脹、腹瀉等不良反應(yīng)。因此，研發(fā)具有降糖效果且安全性更高的藥食同源類治療藥物成為目前糖尿病治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本研究以天麻為原料，采用超聲輔助酶法提取天麻多酚，經(jīng)大孔樹脂分離純化后濃縮冷凍干燥得到純化后天麻多酚樣品，通過分析天麻多酚對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用及抑制類型，可知天麻多酚具有較好的降血糖活性，通過本研究證明開發(fā)天麻多酚作為降血糖藥物具有廣闊的應(yīng)用前景。

本研究通過UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS技術(shù)對純化后的天麻多酚提取物進(jìn)行分析，共鑒定出30 種多酚類化合物，包含黃酮類化合物23 種、酚酸類化合物2 種和酚類化合物5 種，其中天麻多酚中鑒定出的多酚類化合物成分具有降血糖作用。例如，千層紙素甲-7-O-葡萄糖醛酸能夠通過激活胰島素信號(hào)通路的關(guān)鍵分子，其本身所具有的黃酮骨架是降血糖活性的核心，可通過氫鍵或疏水作用與核受體結(jié)合，調(diào)節(jié)糖脂代謝，其共軛體系可清除活性氧自由基，保護(hù)胰島β細(xì)胞，間接改善血糖異常。C2＝C3雙鍵和C4＝O羰基是黃酮類化合物發(fā)揮抗氧化和調(diào)節(jié)糖代謝的關(guān)鍵位點(diǎn)，可能通過清除自由基或激活A(yù)MPK等通路改善胰島素抵抗。葡萄糖醛酸結(jié)構(gòu)可能與酶活性中心競爭性結(jié)合，延緩碳水化合物的分解。紫檀芪是一種天然的二苯乙烯類化合物，結(jié)構(gòu)類似于白藜蘆醇，但因其甲氧基取代和更高的生物利用度，在降血糖方面表現(xiàn)出更強(qiáng)的活性。其降血糖作用主要是通過激活A(yù)MPK通路、抗氧化、抗炎等多重機(jī)制實(shí)現(xiàn)。甲氧基的疏水性可能促進(jìn)與AMPK γ亞基的變構(gòu)結(jié)合從而增強(qiáng)AMPK激活作用，4’-位修飾的調(diào)控可能增強(qiáng)過氧化物酶體增殖物激活受體α激活從而促進(jìn)脂肪酸β-氧化，改善胰島素抵抗力。其次，本研究系統(tǒng)地分析了天麻多酚對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性，并對其酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了分析，探究其降血糖活性。結(jié)果顯示，天麻多酚對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均有抑制活性，且質(zhì)量濃度越高，抑制活性越強(qiáng)。對α-淀粉酶為反競爭性-非競爭性混合抑制，IC50為（0.057±0.011）mg/mL；對α-葡萄糖苷酶為競爭性-非競爭性混合抑制，IC50為（0.189±0.017）mg/mL。綜上所述，天麻多酚具有較好的體外α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制作用，表明天麻多酚具有潛在的降血糖作用，本研究結(jié)果為天麻作為降血糖功能藥品、食品的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

本文《天麻多酚成分鑒定及其對

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