中文摘要

隨著微針技術(shù)的快速發(fā)展，微針逐漸成為新興的疫苗遞送方式，其具有微創(chuàng)、無痛、自給藥、節(jié)省劑量、增強(qiáng)免疫應(yīng)答等優(yōu)勢。免疫原性評價對疫苗的研發(fā)至關(guān)重要，目前尚無對微針疫苗免疫原性評價方法的系統(tǒng)性總結(jié)。此文概述了微針疫苗免疫應(yīng)答的特點(diǎn)，系統(tǒng)梳理和討論了用于評價微針疫苗免疫原性的各種方法及關(guān)鍵指標(biāo)，并對新興免疫原性評價方法在微針疫苗領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行了探討和展望。

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正文

微針是新興的微創(chuàng)經(jīng)皮給藥技術(shù)，其微小的針狀結(jié)構(gòu)能夠在不刺激神經(jīng)的情況下穿透皮膚角質(zhì)層進(jìn)入更深的組織，并增強(qiáng)各種藥物或疫苗的皮膚滲透率。相比于傳統(tǒng)注射方式，微針具有微創(chuàng)、無痛、自給藥、冷鏈依賴少等優(yōu)勢，當(dāng)前已在滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗和核酸疫苗等多種疫苗接種中表現(xiàn)出了良好的免疫效果，成為了疫苗遞送領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。由于疫苗經(jīng)皮遞送可能改變抗原的呈遞動力學(xué)與局部免疫微環(huán)境，進(jìn)而影響微針疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答模式，因此在微針疫苗的研發(fā)中，系統(tǒng)評估微針疫苗的免疫原性至關(guān)重要。這不僅是驗證其有效性的核心依據(jù)，也是深入了解其作用機(jī)制、優(yōu)化遞送策略的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本文系統(tǒng)梳理和討論免疫原性評價方法在微針疫苗中的應(yīng)用，以期為相關(guān)研究提供方法學(xué)參考。

1

微針疫苗概述

皮膚主要由角質(zhì)層、表皮層和真皮層組成，其中角質(zhì)層厚10~20 μm；表皮層厚達(dá)1 500 μm，含有豐富的APC，如朗格漢斯細(xì)胞；真皮層含有豐富的血管、淋巴管、神經(jīng)末梢和一些APC（如真皮樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等）。這些APC被抗原激活后，可以離開感染部位進(jìn)入淋巴管，并遷移至局部淋巴結(jié)以誘導(dǎo)有效和持久的適應(yīng)性免疫應(yīng)答。微針疫苗的核心機(jī)制為：微針穿刺皮膚角質(zhì)層后，迅速觸發(fā)先天免疫應(yīng)答；釋放局部炎癥因子，募集并促進(jìn)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤；同時激活皮膚內(nèi)的APC，使其遷移至引流淋巴結(jié)；此類活化的APC高表達(dá)共刺激分子，從而顯著增強(qiáng)T細(xì)胞/B細(xì)胞的活化與適應(yīng)性免疫應(yīng)答。微針的長度通常為100~1 500 μm，在穿刺過程中微針貼片可直接將抗原輸送至表皮層或真皮上層，避免接觸真皮中的神經(jīng)末梢，具有無痛的優(yōu)勢。微針本身的物理刺激也能在一定程度上起到佐劑作用，增強(qiáng)免疫應(yīng)答。與傳統(tǒng)的注射疫苗相比，微針疫苗還具有劑量節(jié)約效應(yīng)、能夠誘導(dǎo)強(qiáng)大的黏膜免疫（這對于應(yīng)對呼吸道/消化道病毒尤為重要）、偏向Th1型的細(xì)胞免疫應(yīng)答及長效免疫記憶等優(yōu)勢。近年來，微針技術(shù)在皮膚貼片接種疫苗方面取得了顯著進(jìn)展，其中麻疹-風(fēng)疹疫苗進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗，流感疫苗和腦炎疫苗進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗，還有多種微針疫苗處于臨床前研究階段。不同類型的微針在疫苗及藥物中已得到廣泛應(yīng)用，其遞送機(jī)制存在一定的差異，見表1。

2

免疫原性評價方法在微針疫苗中的應(yīng)用

為全面評估微針疫苗獨(dú)特的免疫應(yīng)答能力，其免疫原性評價方法除了包含傳統(tǒng)疫苗評價方法，還注重抗原遞送效率和針對皮膚的免疫特性的測定。在遞送效率評估方面，研究者主要通過高效液相色譜、BCA法、活體熒光成像等方法定量和定性微針在皮膚中的溶解釋放和遞送過程，這些方法的應(yīng)用證實了微針疫苗具有精準(zhǔn)、高效遞送的優(yōu)勢。在局部免疫應(yīng)答評價方面，已有研究主要應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色（intracellular cytokine staining，ICS）、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗（enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT）等方法深度剖析皮膚和引流淋巴結(jié)的細(xì)胞因子水平，反映微針疫苗誘導(dǎo)的初始免疫應(yīng)答情況。在系統(tǒng)免疫應(yīng)答評價方面，微針疫苗評價與傳統(tǒng)疫苗評價方法類似，主要包含體液免疫和細(xì)胞免疫評價，通過ELISA檢測特異性抗體、病毒中和試驗（virus neutralization test，VNT）檢測中和抗體、FCM檢測T細(xì)胞分型等評估免疫應(yīng)答水平。上述評價方法的綜合應(yīng)用為微針疫苗的免疫原性提供了證據(jù)支持。傳統(tǒng)疫苗與微針疫苗免疫原性評價指標(biāo)與檢測方法對比見表2。

2.1

抗原遞送效率測定

盡管與肌肉組織相比，皮膚因含有豐富的APC和免疫輔助細(xì)胞而被認(rèn)為是理想的免疫部位，但是相較于傳統(tǒng)疫苗注射的精準(zhǔn)遞送抗原劑量，微針疫苗實際遞送劑量則取決于載藥量及遞送率，要求劑量足夠、靶向定位、結(jié)構(gòu)完整。微針疫苗的實際抗原遞送量和遞送效率對評估其免疫效果起關(guān)鍵作用。目前，微針疫苗的抗原遞送主要通過定量和定性方式進(jìn)行評估，常見評估方法見表3。

抗原的高效遞送是引發(fā)強(qiáng)大免疫應(yīng)答的先決條件，在研發(fā)微針疫苗時，應(yīng)根據(jù)疫苗類型的特點(diǎn)選擇最佳的評價方法。如Kim等研發(fā)了涂覆乙型肝炎亞單位疫苗的微針，經(jīng)Bradford比色法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量和ELISA量化負(fù)載量，確保了涂層微針的有效抗原遞送量。Wang等在制備猴痘DNA可溶性微針疫苗時，通過高效液相色譜定量分析了微針貼片使用前后DNA濃度。結(jié)果顯示，每個貼片含有（18.26±0.69） μg DNA，將其應(yīng)用于小鼠皮膚后，貼片殘留DNA為（5.7±1.4） μg，遞送效率約70%。最終通過免疫印跡法和免疫熒光證實了目標(biāo)抗原在體內(nèi)的有效表達(dá)。

此外，單向免疫擴(kuò)散法是檢測流感微針疫苗抗原含量的標(biāo)準(zhǔn)方法。其他病毒疫苗（如麻疹-風(fēng)疹疫苗等）、亞單位疫苗（如新型冠狀病毒疫苗、寨卡病毒疫苗）、核酸疫苗（如新型冠狀病毒mRNA疫苗、埃博拉病毒DNA疫苗等）同樣選取了上述2~3種方法綜合測定了抗原遞送效率，且體內(nèi)免疫原性研究表明，微針疫苗均產(chǎn)生了良好的免疫效果。

2.2

局部免疫應(yīng)答評價

局部免疫應(yīng)答評價是證明微針疫苗能夠?qū)崿F(xiàn)劑量節(jié)約效應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，同時通過分析細(xì)胞因子和趨化因子譜，可以了解免疫應(yīng)答的偏向、強(qiáng)度和類型。例如，IFN-γ、IL-2等Th1型細(xì)胞因子的升高表明免疫應(yīng)答偏向細(xì)胞免疫，而IL-4、IL-10等Th2型細(xì)胞因子的增加則表明免疫應(yīng)答與體液免疫相關(guān)。趨化因子如C-C趨化因子配體3、4、10等能夠反映接種部位免疫細(xì)胞的招募情況，其水平的增高是微針疫苗誘導(dǎo)高效免疫應(yīng)答的關(guān)鍵。通過FCM、ICS、Luminex多因子檢測法及免疫熒光染色等方法監(jiān)測細(xì)胞因子和趨化因子水平，可以準(zhǔn)確評估微針疫苗誘導(dǎo)的強(qiáng)大的免疫應(yīng)答。

在1項可溶性微針疫苗免疫誘導(dǎo)機(jī)制的研究中，研究人員給小鼠接種微針疫苗24 h后對皮膚組織進(jìn)行單細(xì)胞RNA測序（single-cell RNA sequencing， scRNA-seq），發(fā)現(xiàn)約650個基因的表達(dá)顯著上調(diào)，尤以IL-1β、IL-7最為顯著，反轉(zhuǎn)錄定量PCR驗證關(guān)鍵基因的表達(dá)變化和蘇木精-伊紅染色觀察皮膚炎癥反應(yīng)等結(jié)果也證實了這一點(diǎn)。此外，1項動物研究通過基因表達(dá)譜分析、蘇木精-伊紅染色和免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，微針貼片通過調(diào)控局部細(xì)胞因子和趨化因子網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)了APC向引流淋巴結(jié)的遷移，從而增強(qiáng)了機(jī)體免疫應(yīng)答。

采用ELISPOT、FCM、ICS等檢測技術(shù)獲得的大量數(shù)據(jù)表明，多數(shù)抗病毒微針疫苗可誘導(dǎo)IL-1β、IFN-γ等Th1型細(xì)胞因子水平顯著升高，提示其傾向于激發(fā)強(qiáng)大的細(xì)胞免疫應(yīng)答，這對抗病毒免疫至關(guān)重要。

2.3

體液免疫應(yīng)答評價

體液免疫應(yīng)答的核心評價指標(biāo)一般包括特異性抗體滴度、中和抗體滴度、抗體親和力等。

2.3.1　抗原特異性抗體檢測抗原特異性抗體的數(shù)量能夠反映疫苗誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答的水平。當(dāng)前，研究人員多采用ELISA檢測抗原特異性抗體。Wen等研發(fā)了脂質(zhì)體負(fù)載的可溶性微針乙型肝炎疫苗貼片，通過ELISA定量檢測小鼠血清中抗HBV表面抗原 IgG水平。結(jié)果顯示，在所有時間點(diǎn)，較高劑量的可溶性微針皮內(nèi)給藥均誘導(dǎo)了高水平抗HBV表面抗原滴度，0.1~2.0 μg范圍內(nèi)的免疫效果呈劑量依賴性。

傳統(tǒng)疫苗因接種途徑多在肌內(nèi)或皮下而無法誘導(dǎo)有效的黏膜免疫應(yīng)答，微針疫苗經(jīng)皮或黏膜遞送，不僅能激活全身免疫應(yīng)答，還能激活局部黏膜免疫應(yīng)答。根據(jù)病原體的傳播方式不同，在評價時有些研究也檢測IgA抗體滴度。Li等研發(fā)了新型冠狀病毒DNA微針疫苗，通過ELISA檢測了接種小鼠血清中新型冠狀病毒刺突特異性抗體（IgG、IgA、IgG1和IgG2c）滴度以及核衣殼特異性IgG抗體滴度。結(jié)果顯示，在免疫后第3、6周，微針組不僅誘導(dǎo)了與肌內(nèi)注射組相當(dāng)?shù)拇掏?核衣殼特異性IgG抗體滴度，而且誘導(dǎo)了顯著高于肌內(nèi)注射組的刺突特異性分泌型IgA抗體水平，這表明微針疫苗不僅誘導(dǎo)了與肌內(nèi)注射組相當(dāng)?shù)捏w液免疫應(yīng)答，而且引發(fā)了有效的黏膜免疫應(yīng)答。多項研究表明，經(jīng)微針遞送的流感病毒疫苗、新型冠狀病毒疫苗、滅活輪狀病毒疫苗等均誘導(dǎo)了有效的黏膜免疫應(yīng)答，增強(qiáng)了疫苗對機(jī)體的保護(hù)作用。

2.3.2　中和抗體檢測病毒中和試驗通常用于檢測機(jī)體血清中可有效中和病原體的抗體量。在微針疫苗免疫原性評價中常用的病毒中和試驗類型主要包括假病毒中和試驗、嗜斑減少中和試驗、微量中和試驗等。Fan等通過假病毒中和試驗檢測了針對野生型新型冠狀病毒及其變異株的中和抗體水平，研究結(jié)果證實，基于微針遞送的DNA疫苗策略在誘導(dǎo)廣譜中和抗體方面具有顯著優(yōu)勢，這種優(yōu)勢為應(yīng)對病毒變異提供了潛在替代方案。另有研究在對比混合抗原、分區(qū)抗原微針疫苗誘導(dǎo)的中和抗體水平時，通過噬斑減少中和試驗發(fā)現(xiàn)，2種單價疫苗混合和雙室微針聯(lián)合疫苗的中和效果無明顯差異且與肌內(nèi)注射組相當(dāng)，這證明了雙室微針陣列能夠避免傳統(tǒng)混合疫苗的免疫干擾問題。此外，1項滅活輪狀病毒微針疫苗研究通過微量中和試驗證實了微針疫苗比肌內(nèi)注射疫苗更高效地誘導(dǎo)了中和抗體。上述方法與傳統(tǒng)疫苗的評價方法基本一致。未來，研究人員可通過綜合評估病毒中和試驗方法的優(yōu)缺點(diǎn)，選擇最優(yōu)評價方法。

2.3.3　抗體親和力檢測抗體親和力是指抗原與抗體結(jié)合的強(qiáng)度。常用抗體親和力檢測方法包括硫氰酸胍洗脫ELISA和表面等離子體共振。

研究表明，微針疫苗能夠誘導(dǎo)更高親和力的抗體。Littauer等采用ELISA檢測流感微針貼片疫苗誘導(dǎo)的抗體，通過在血清樣本中添加不同濃度的硫氰酸胍測定抗原與抗體結(jié)合的強(qiáng)度。含佐劑的微針疫苗組相比于單獨(dú)微針組抗體親和力顯著增加，且高親和力抗體與長期免疫保護(hù)呈正相關(guān)。硫氰酸胍洗脫ELISA檢測抗體親和力雖然操作簡便且靈敏度較高，但是只能測得相對親和力，無法精確測定其解離常數(shù)。利用金屬表面的等離子共振現(xiàn)象能夠?qū)崟r監(jiān)測抗原-抗體結(jié)合的過程，通過計算可測得解離常數(shù)。在1項可溶性微針貼片遞送流感滅活疫苗的Ⅰ期臨床試驗中，研究者使用ProteOn表面等離子體共振生物傳感器在25 ℃監(jiān)測疫苗接種后血清的穩(wěn)態(tài)平衡結(jié)合，分析了抗原-抗體親和力。結(jié)果表明，與基線相比，在接種后第28天，微針組觀察到了抗原-抗體親和力的顯著增加。

2.4

細(xì)胞免疫應(yīng)答評價

T細(xì)胞亞群的數(shù)量及比例、關(guān)鍵細(xì)胞因子水平等指標(biāo)的檢測對微針疫苗的設(shè)計研發(fā)起重要指導(dǎo)作用。

2.4.1　CD4+/CD8+ T細(xì)胞分型檢測CD4+ T細(xì)胞亞群比例及CD8+ T細(xì)胞活化水平能夠反映細(xì)胞免疫應(yīng)答的類型與強(qiáng)度。T細(xì)胞分型檢測可驗證微針疫苗能否有效激活CD4+和CD8+ T細(xì)胞，并誘導(dǎo)兩者產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。

與傳統(tǒng)疫苗的檢測方法一致的是，F(xiàn)CM利用T細(xì)胞表面特異性標(biāo)志物可區(qū)分CD4?和CD8? T細(xì)胞，定量其比例和數(shù)量，從而評估微針疫苗誘導(dǎo)的T細(xì)胞免疫特征。在1項COVID-19 DNA疫苗可分離微針（separable microneedle，SMN）的研究中，研究人員通過FCM檢測小鼠脾臟細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)SMN疫苗相比，含佐劑的SMN疫苗誘導(dǎo)了更高水平的IFN-γ+/IL-2+ CD8+效應(yīng)記憶T細(xì)胞；此外，通過FCM結(jié)合分析新型冠狀病毒特異性IFN-γ+/IL-2+CD4+ T細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，用含佐劑的SMN接種疫苗可以顯著增加相關(guān)T細(xì)胞的數(shù)量，這說明了免疫刺激劑可能有助于激發(fā)體液免疫應(yīng)答。

2.4.2　細(xì)胞因子分泌檢測細(xì)胞因子分泌可通過ELISA、ELISPOT、ICS聯(lián)合FCM等方法來檢測。

ELISA可用于定量檢測細(xì)胞因子含量，ELISPOT可用于定量檢測分泌特定細(xì)胞因子的細(xì)胞數(shù)量。研究表明，與傳統(tǒng)疫苗相比，微針疫苗更優(yōu)的免疫原性源于其激活了更高比例的多功能T細(xì)胞。ELISA和ELISPOT無法很好地評估分泌多種細(xì)胞因子的細(xì)胞數(shù)量。為此，現(xiàn)有研究采用ICS聯(lián)合FCM，在單細(xì)胞水平上進(jìn)行細(xì)胞表型與功能的多維度分析，以此證明微針疫苗誘導(dǎo)了相比于傳統(tǒng)疫苗更高比例的多功能T細(xì)胞。例如，F(xiàn)an等研究的COVID-19 DNA微針疫苗，通過ICS聯(lián)合FCM檢測小鼠引流淋巴結(jié)和脾臟，證實了微針組表達(dá)IL-2、IFN-γ、TNF-α的T細(xì)胞的數(shù)量顯著高于肌內(nèi)注射組和空白對照組。這表明經(jīng)微針遞送疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。

3

免疫原性評價方法創(chuàng)新進(jìn)展

對于微針疫苗免疫原性評價，目前使用的技術(shù)如ELISA、病毒中和試驗、ELISPOT、FCM等雖可廣泛評估微針疫苗接種后T細(xì)胞或體液區(qū)室中的反應(yīng)，但無法精準(zhǔn)地評估單個免疫細(xì)胞之間的反應(yīng)差異。

ELISA的最低檢測限受其顯色方法靈敏度的限制，難以精確檢測抗體滴度，需要靈敏度更高、多靶標(biāo)檢測的抗體檢測方法，如Ella全自動微流控ELISA、化學(xué)發(fā)光酶免疫測定法（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）。前者已在新型冠狀病毒mRNA疫苗研發(fā)中被廣泛應(yīng)用；后者在檢測低濃度Ig時性能顯著，可用于疫苗接種早期檢測低濃度抗新型冠狀病毒抗體。這些新方法在傳統(tǒng)疫苗中的應(yīng)用為微針疫苗的免疫原性評價提供了新方向。

近年來，scRNA-seq、質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)、CLEIA、微流控技術(shù)等新興方法的出現(xiàn)，為微針疫苗領(lǐng)域提供了新的評價工具。scRNA-seq可用于表征單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組。研究人員通過對單個細(xì)胞RNA進(jìn)行測序，能夠揭示細(xì)胞間的異質(zhì)性及亞群多樣性。此外，該技術(shù)還具備在單細(xì)胞水平解析疫苗接種反應(yīng)機(jī)制的優(yōu)勢。質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)融合了質(zhì)譜的精確性、無需補(bǔ)償計算、金屬標(biāo)簽標(biāo)記，能夠以單細(xì)胞分辨率同時測量多達(dá)50個細(xì)胞特征，增強(qiáng)了FCM的能力。這種技術(shù)已用于鑒定新型流感疫苗特異性CD4+ T細(xì)胞亞群。CLEIA憑借其高靈敏度、多靶向性的優(yōu)勢已用于新型冠狀病毒疫苗早期抗體檢測。微流控技術(shù)也是近年來在FCM領(lǐng)域中出現(xiàn)的新興技術(shù)。微流控設(shè)備根據(jù)細(xì)胞的物理性質(zhì)通過機(jī)械過濾器對細(xì)胞進(jìn)行無標(biāo)簽細(xì)胞分選，彌補(bǔ)了FCM在時間分辨率上的不足。這些新興技術(shù)為傳統(tǒng)疫苗的免疫原性評價開辟了新途徑，有望應(yīng)用于微針疫苗的免疫原性評價。

4

總結(jié)與展望

微針作為創(chuàng)新性的疫苗遞送平臺可以有效激發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答，已得到廣泛驗證。在免疫原性評價方面，針對高質(zhì)量的免疫應(yīng)答，目前研究者已經(jīng)整合了諸如ICS、FCM、CLEIA、scRNA-seq等多項高通量、高靈敏度技術(shù)，以在單細(xì)胞水平分析免疫細(xì)胞的活化、分化和記憶形成。同時，活體成像技術(shù)等新興技術(shù)為實時、原位觀察抗原遞呈與免疫激活過程提供了新視角，深化了對微針疫苗作用機(jī)制的理解。盡管如此，目前有關(guān)微針疫苗免疫機(jī)制的研究尚不充分，微針疫苗免疫原性尚未有統(tǒng)一且規(guī)范的評價體系，多數(shù)微針疫苗尚未開展長期臨床研究。未來研究應(yīng)進(jìn)一步聚焦于以上幾個方面，微針疫苗才能有望在不久的將來大比例替代傳統(tǒng)疫苗的接種方式，為公共衛(wèi)生事業(yè)做出貢獻(xiàn)。

作者

劉衛(wèi)華1,2 王可慧2 鄒大陽2 李顯煌2 王彬3 李琳昊2 都星月2 周人輝2 秦日輝2 徐雅晴2 劉威1,2

1中國醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)教研室，沈陽 110122；2解放軍疾病預(yù)防控制中心免疫規(guī)劃科，北京 100070；3安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)系，合肥 230032

通信作者：劉威，

Email：liuwei5269@qq.com

引用本文：劉衛(wèi)華, 王可慧, 鄒大陽, 等. 免疫原性評價方法在微針疫苗中的應(yīng)用進(jìn)展 [J]. 國際生物制品學(xué)雜志, 2026, 49(2): 127-134.

DOI:10.3760/cma.j.cn311962-20250611-00045

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撰寫| 國際生物制品學(xué)雜志

校稿| Gddra編審| Hide / Blue sea

編輯 設(shè)計| Alice