近年來，CRISPR-Cas基因編輯技術(shù)已成為生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的革命性工具。然而，傳統(tǒng)Cas蛋白（如Cas9、Cas12a）體積較大，超出了腺相關(guān)病毒（AAV）載體的包裝極限（<4.7 kb），嚴(yán)重限制了其在體內(nèi)基因治療中的應(yīng)用。因此，開發(fā)更小、更高效的基因調(diào)控系統(tǒng)，成為推動(dòng)臨床轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵突破口。

近日，中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院林天歆教授與陳旭教授團(tuán)隊(duì)在《自然·通訊》（Nature Communications）上發(fā)表題為《Miniature and versatile genome regulation TnpB-wRNA toolkits facilitate cancer immunotherapy》的研究論文。該研究通過對(duì)微型轉(zhuǎn)座子編碼核酸酶TnpB及其配套ωRNA的系統(tǒng)性工程化改造，成功構(gòu)建出一套名為“enTnpB”的緊湊、高效且多功能的基因調(diào)控工具箱，并在癌癥免疫治療中展現(xiàn)出顯著療效。

研究團(tuán)隊(duì)首先對(duì)TnpB的向?qū)NA——ωRNA進(jìn)行了五輪理性設(shè)計(jì)。通過截短5’端非結(jié)構(gòu)化區(qū)域、修剪遠(yuǎn)端莖環(huán)、替換不穩(wěn)定四環(huán)等策略，最終將ωRNA從原始的231個(gè)核苷酸縮短至93個(gè)核苷酸，同時(shí)將基因激活效率提升近1890倍。隨后，團(tuán)隊(duì)對(duì)TnpB蛋白進(jìn)行三輪定點(diǎn)突變篩選，發(fā)現(xiàn)將第255位天冬酰胺和第282位脯氨酸同時(shí)替換為精氨酸（N255R/P282R），可顯著增強(qiáng)其DNA結(jié)合能力。結(jié)合優(yōu)化后的ωRNA，最終形成的基因激活系統(tǒng)“enTnpBa”在報(bào)告基因上實(shí)現(xiàn)了2889倍的激活提升，且體積遠(yuǎn)小于此前報(bào)道的緊湊型激活劑CasMINI。全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序顯示，enTnpBa具有高度特異性，脫靶效應(yīng)極低。

在功能拓展方面，團(tuán)隊(duì)基于enTnpB平臺(tái)成功開發(fā)了高效基因編輯器（enTnpB-GE）和腺嘌呤堿基編輯器（enTnpB-ABE）。其中，基因編輯器GE，且未檢測(cè)到明顯的脫靶事件；堿基編輯器ABE-γ和IL-15等多個(gè)位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)了最高16.2%的A-to-G轉(zhuǎn)換，編輯窗口主要集中在間隔序列的第3至第10位。

最具轉(zhuǎn)化潛力的是，研究團(tuán)隊(duì)利用enTnpBa的緊湊特性，將三個(gè)分別靶向CXCL9、IFN-γ和IL-15的ωRNA陣列與工程化TnpB蛋白一同包裝進(jìn)單個(gè)AAV載體，構(gòu)建出名為“AAV-ImmunAct”的單AAV免疫激活系統(tǒng)。在體外，該系統(tǒng)能顯著上調(diào)三種細(xì)胞因子的表達(dá)，并有效招募和激活CD8+ T細(xì)胞，增強(qiáng)其對(duì)膀胱癌細(xì)胞系及患者來源腫瘤類器官的殺傷能力。在采用人源化免疫重建小鼠的體內(nèi)模型中，AAV-ImmunAct聯(lián)合抗PD-1治療顯著抑制了腫瘤生長(zhǎng)，促進(jìn)了CD8+ T細(xì)胞浸潤(rùn)和顆粒酶B表達(dá)，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

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