近期，阮氏Truc Linh及其團(tuán)隊(duì)開(kāi)展專項(xiàng)科研實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)評(píng)估了玫瑰茄葉提取物針對(duì)引發(fā)南美白對(duì)蝦急性肝胰壞死的副溶血弧菌的抗藥性抑制效果，同時(shí)深入探究該提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)用南美白對(duì)蝦生長(zhǎng)速率及機(jī)體免疫反應(yīng)的調(diào)控作用，為水產(chǎn)養(yǎng)殖中細(xì)菌性病害的綠色防控提供了全新的天然產(chǎn)物參考依據(jù)。

一、研究背景：對(duì)蝦急性肝胰壞死病害的危害與防控痛點(diǎn)

急性肝胰壞死（Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease, AHPND），又稱早期蝦死亡綜合征（EMS），是全球南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖領(lǐng)域危害極為嚴(yán)重的烈性傳染性病害，該病發(fā)病急、傳播快，可導(dǎo)致對(duì)蝦在短周期內(nèi)出現(xiàn)大規(guī)模批量死亡，直接造成巨大的養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

現(xiàn)有研究證實(shí)，攜帶PirA、PirB毒力基因編碼質(zhì)粒的副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VpAHPND）是誘發(fā)AHPND的主要致病菌（Tran等，2013；世界動(dòng)物衛(wèi)生組織OIE，2019）。除此之外，哈維弧菌（V. harveyi）、坎貝爾弧菌（V. campbellii）、歐文斯弧菌（V. owensii）及普內(nèi)西斯弧菌（V. punensis）等菌株，因部分?jǐn)y帶與AHPND致病質(zhì)粒序列高度同源的毒素基因，同樣被認(rèn)定為AHPND的重要潛在致病因子（Restrepo等，2018）。更值得警惕的是，Lee等（2022）研究發(fā)現(xiàn)，健康對(duì)蝦接觸-80℃低溫保存的AHPND感染病蝦后，依舊存在較高的感染風(fēng)險(xiǎn)，這也進(jìn)一步凸顯了該病害防控的復(fù)雜性與緊迫性。

二、試驗(yàn)材料：玫瑰茄的資源特性與天然抗菌潛力

在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，天然草本提取物的抗菌活性是當(dāng)前生物防控方向研究最為廣泛的核心內(nèi)容，憑借綠色安全、無(wú)殘留、不易誘發(fā)耐藥性等優(yōu)勢(shì)，具備極高的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用潛力（Reverter等，2017）。多數(shù)具備抗菌功效的草本提取物中，核心活性成分為生物堿、糖苷類、多酚類及萜烯類化合物，這類天然物質(zhì)是發(fā)揮抑菌殺菌作用的關(guān)鍵（Ahn，2017）。相較于人工合成抗菌劑，天然草藥應(yīng)用具備多重核心優(yōu)勢(shì)：原料成本低廉、本土資源易得、制備工藝簡(jiǎn)便、可自然生物降解，且全程對(duì)養(yǎng)殖水體與周邊環(huán)境無(wú)負(fù)面影響，完全契合生態(tài)水產(chǎn)養(yǎng)殖的發(fā)展理念（Syahidah等，2015）。

近年來(lái)，學(xué)界陸續(xù)開(kāi)展多項(xiàng)研究，篩選能夠提升對(duì)蝦弧菌抗性、強(qiáng)化機(jī)體免疫功能的天然草本提取物，為對(duì)蝦綠色養(yǎng)殖病害防控提供了新方向（Ghosh等，2021）。本研究選用的玫瑰茄（Hibiscus sabdariffa），是越南沿海地區(qū)廣泛分布的野生鄉(xiāng)土植物，環(huán)境適應(yīng)性極強(qiáng)，可在淡水、微咸水及咸水周邊土壤中正常生長(zhǎng)，資源儲(chǔ)量豐富、取材便捷。

據(jù)Loi（2004）研究記載，玫瑰茄本身具備防腐、利尿及抗氧化等多重生物活性；其葉片中富含戈戈汀、花青素類、黃酮類葡萄糖苷洛伊比斯克里汀、核黃素、抗壞血酸、煙酸、胡蘿卜素、鈣、鐵等多種活性化學(xué)成分，為其抗菌活性提供了物質(zhì)基礎(chǔ)（Lade等，2022）。已有前期研究證實(shí)，玫瑰茄提取物對(duì)多種革蘭氏陰性菌（創(chuàng)傷弧菌、嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、大腸桿菌、腸道沙門氏菌、肺炎克雷伯菌、普魯加里氏菌、銅綠假單胞菌）和革蘭氏陽(yáng)性菌（金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、變異單胞菌、蠟狀芽孢桿菌）均具備顯著的抑菌活性（Abdallah，2016；Abass等，2022；Lade等，2022）。但截至本研究開(kāi)展前，學(xué)界尚未有針對(duì)玫瑰茄提取物在水生生物領(lǐng)域應(yīng)用的系統(tǒng)性研究，尤其缺乏其對(duì)養(yǎng)殖對(duì)蝦致病性弧菌的抑制效果、促生長(zhǎng)作用及免疫增強(qiáng)功效的專項(xiàng)驗(yàn)證，這也是本研究的核心創(chuàng)新點(diǎn)與研究空白填補(bǔ)方向。

三、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施流程

（一）玫瑰茄葉提取物制備

研究團(tuán)隊(duì)從越南沿海不同區(qū)域分三批次采集新鮮玫瑰茄葉片作為試驗(yàn)原料，采用統(tǒng)一流程處理：首先將葉片徹底清洗去除雜質(zhì)與表面污染物，隨后在50℃恒溫條件下烘干脫水，再經(jīng)研磨處理制成細(xì)膩粉末；后續(xù)采用三種不同溶劑分別開(kāi)展提取試驗(yàn)，具體分為三組：方法一為甲醇溶劑提取組，方法二為乙醇溶劑提取組，方法三為熱水浸提組，以此對(duì)比不同提取方式下提取物的活性差異。

（二）實(shí)驗(yàn)用蝦篩選與養(yǎng)殖管理

本研究選用無(wú)特定病原南美白對(duì)蝦作為試驗(yàn)對(duì)象，蝦苗處于PL15階段，經(jīng)專業(yè)檢測(cè)確認(rèn)白斑綜合征病毒、微孢子蟲(chóng)及急性肝胰壞死致病菌均為陰性，保證試驗(yàn)材料的純凈性。試驗(yàn)用蝦在茶榮大學(xué)農(nóng)漁學(xué)院實(shí)驗(yàn)養(yǎng)殖池塘中標(biāo)準(zhǔn)化培育，直至單尾蝦體重達(dá)到10.54±0.39g、體長(zhǎng)達(dá)到11.61±0.23cm，滿足試驗(yàn)規(guī)格要求。

在轉(zhuǎn)入試驗(yàn)養(yǎng)殖池前，參照Sirikharin等（2015）的方法，結(jié)合OIE（2009）標(biāo)準(zhǔn)，采用特異性引物PCR法與熱循環(huán)法，再次對(duì)所有試驗(yàn)蝦進(jìn)行白斑病原體及AHPND致病菌檢測(cè)，確認(rèn)全部為陰性后，將對(duì)蝦放入試驗(yàn)池進(jìn)行3天環(huán)境馴化，使其適應(yīng)池內(nèi)水質(zhì)、養(yǎng)殖密度等環(huán)境條件，馴化結(jié)束后正式開(kāi)展飼喂試驗(yàn)。

（三）生長(zhǎng)指標(biāo)與免疫指標(biāo)檢測(cè)

本研究試驗(yàn)周期為30天，試驗(yàn)期間每10天進(jìn)行一次生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定，每次從每個(gè)試驗(yàn)池中隨機(jī)捕撈5尾對(duì)蝦，精準(zhǔn)測(cè)量單尾蝦的體長(zhǎng)與體重，系統(tǒng)記錄數(shù)據(jù)并分析玫瑰茄葉提取物添加飼料對(duì)南美白對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的影響。同時(shí)，研究團(tuán)隊(duì)同步開(kāi)展多項(xiàng)體外與體內(nèi)試驗(yàn)，全面評(píng)估不同溶劑提取的玫瑰茄葉提取物對(duì)副溶血弧菌的耐藥性抑制效果，以及其對(duì)南美白對(duì)蝦生長(zhǎng)性能、機(jī)體免疫反應(yīng)的綜合調(diào)控作用。

四、實(shí)驗(yàn)核心結(jié)果與研究結(jié)論

（一）不同提取物對(duì)副溶血弧菌的抗菌效果

試驗(yàn)結(jié)果表明，三種提取方式制備的玫瑰茄葉提取物，對(duì)AHPND致病菌副溶血弧菌均表現(xiàn)出顯著的抗菌活性，其中甲醇溶劑提取物的抗菌效果最優(yōu)，平均抑菌圈直徑達(dá)到24.9±0.6mm，抑菌效果近乎是陽(yáng)性對(duì)照組（平均抑菌圈直徑16.2±0.6mm）的1.5倍，該結(jié)果與同類天然提取物抗菌研究結(jié)論完全一致。究其原因，甲醇的極性高于乙醇，極性差異直接影響提取物中活性成分的溶出效率，進(jìn)而使得甲醇提取組的抑菌圈直徑顯著大于乙醇提取組，熱水提取組抗菌效果介于兩者之間。

進(jìn)一步藥敏試驗(yàn)檢測(cè)顯示，玫瑰茄葉甲醇提取物針對(duì)副溶血弧菌的最小抑菌濃度（MIC）為0.02mg/mL，最小殺菌濃度（MBC）為0.08mg/mL，極低的有效濃度進(jìn)一步印證了其高效的抗菌殺菌潛力，具備實(shí)際養(yǎng)殖應(yīng)用的可行性。

（二）提取物對(duì)南美白對(duì)蝦生長(zhǎng)與免疫的調(diào)控作用

在30天飼喂試驗(yàn)中，玫瑰茄葉甲醇提取物作為飼料添加劑，在1%和1.5%兩個(gè)添加濃度下，均能顯著促進(jìn)南美白對(duì)蝦的生長(zhǎng)發(fā)育，試驗(yàn)組對(duì)蝦生長(zhǎng)速率明顯優(yōu)于空白對(duì)照組。同時(shí)，免疫指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示，添加1%和1.5%玫瑰茄葉甲醇提取物的試驗(yàn)組，對(duì)蝦總血細(xì)胞數(shù)（THC）、顆粒細(xì)胞數(shù)（GC）及顆粒白細(xì)胞數(shù)（HC）均顯著提升，與空白對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p < 0.05），證實(shí)該提取物可有效激活對(duì)蝦機(jī)體免疫系統(tǒng)，強(qiáng)化非特異性免疫功能，提升對(duì)致病菌的抵抗力。

（三）研究核心結(jié)論

綜合全部試驗(yàn)結(jié)果可得出，玫瑰茄葉提取物尤其是甲醇提取物，對(duì)誘發(fā)對(duì)蝦急性肝胰壞死的副溶血弧菌具備高效的抑菌殺菌作用，可作為針對(duì)性的天然抗菌劑使用；同時(shí)，該提取物作為綠色飼料添加劑，能夠同步實(shí)現(xiàn)促進(jìn)南美白對(duì)蝦生長(zhǎng)、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的雙重功效，是一種極具開(kāi)發(fā)價(jià)值的水產(chǎn)養(yǎng)殖綠色投入品，后續(xù)可進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝與添加劑量，推動(dòng)其在對(duì)蝦生態(tài)養(yǎng)殖中的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。