本文系統(tǒng)梳理了髓母細(xì)胞瘤分子分型的主要技術(shù)方法，涵蓋各層級(jí)策略，詳細(xì)對(duì)比了各項(xiàng)技術(shù)的原理、準(zhǔn)確性、敏感性與特異性、適用場(chǎng)景、樣本要求、成本及操作門檻，并重點(diǎn)分析了各方法在區(qū)分亞型的優(yōu)勢(shì)與局限。同時(shí)，文章結(jié)合臨床實(shí)踐現(xiàn)狀，指出了目前的共性挑戰(zhàn)。

分子分型是該疾病最重要的預(yù)后因素

髓母細(xì)胞瘤是一種胚胎性腫瘤，是全球兒童中第二常見的腫瘤。它的特征是腫瘤內(nèi)和腫瘤間高度異質(zhì)性。目前，世界衛(wèi)生組織認(rèn)可四個(gè)主要分子亞型（WNT型、SHH型、G3型和G4型），這些亞型賦予患者不同的臨床和預(yù)后特征。在不同人群中，已經(jīng)證明分子亞型與存活概率存在關(guān)聯(lián)：WNT型預(yù)后最佳，其次是預(yù)后中等的SHH型和G4型，G3型預(yù)后最差。而組織學(xué)分類不同，僅有一種組織學(xué)類型（間變性大細(xì)胞髓母細(xì)胞瘤）與患者不良預(yù)后相關(guān)，但該類型僅占所有腫瘤的5%-10%。

目前，髓母細(xì)胞瘤的分型采用綜合方式，涵蓋每位患者的臨床、組織學(xué)和分子特征。這是最佳的風(fēng)險(xiǎn)分層工具，也是為每位患者選擇理想治療方案的最佳方法。因此，多項(xiàng)臨床試驗(yàn)已采用這種方法，納入新的化療、放療和免疫治療方案，旨在實(shí)施能提升每位患者治療方案的有效性和安全性。

因此，分子分型的鑒定已成為髓母細(xì)胞瘤臨床診療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。一旦分子亞型分類錯(cuò)誤會(huì)導(dǎo)致治療失敗，即采用強(qiáng)度過高或過低的放療和/或化療方案，將直接影響患者的生活質(zhì)量和預(yù)期壽命（圖1）。

圖1 髓母細(xì)胞瘤的生物學(xué)異質(zhì)性及其臨床意義

低準(zhǔn)確度的分子分型方法

患者的診斷流程始于臨床評(píng)估和影像學(xué)檢查（如CT和MRI），隨后進(jìn)行安全范圍內(nèi)的腫瘤最大切除術(shù)。病理醫(yī)生隨后對(duì)切除組織進(jìn)行研究以明確診斷，通過分子分類進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分層，最終制定治療決策。

基于影像組學(xué)特征的分子分型：在術(shù)前階段，多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)基于影像學(xué)特征，開發(fā)了初步的分子分類方法，如根據(jù)腫瘤位置、造影劑增強(qiáng)情況、水腫、出血或轉(zhuǎn)移這些與分子分型相關(guān)的特征進(jìn)行分類。盡管與最終活檢結(jié)果相比，其敏感性較低（60%-70%）。

基于免疫組化的分子分型：腫瘤常規(guī)切除后，會(huì)置于甲醛中固定，隨后包埋于石蠟進(jìn)行組織病理學(xué)研究，這是經(jīng)典病理學(xué)的核心環(huán)節(jié)。免疫組化是髓母細(xì)胞瘤分類中最常用的技術(shù)之一，通過該方法可識(shí)別SHH型和WNT型髓母細(xì)胞瘤，但主要局限性在于無法區(qū)分G3型和G4型，并就此將其歸為單一亞型（非WNT/非SHH型）。

盡管免疫組化分型具有技術(shù)和經(jīng)濟(jì)可及性的特點(diǎn)，但也存在方法學(xué)局限性，如不同品牌和批次抗體的變異性、基于組織固定和包埋方法的機(jī)構(gòu)間差異，以及觀察者內(nèi)和觀察者間的可重復(fù)性，這些因素直接影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性。例如，多項(xiàng)研究對(duì)核β-catenin陽性的臨界值設(shè)定不同（腫瘤區(qū)域的1%-50%），這可能導(dǎo)致WNT型髓母細(xì)胞瘤的鑒定出現(xiàn)分歧。同時(shí)，也存在其他類型腫瘤被錯(cuò)誤鑒定為髓母細(xì)胞瘤的情況。

基于突變譜的分子分型：通過基因組、外顯子組或靶向測(cè)序分析突變譜，是鑒定WNT型和SHH型腫瘤的另一種實(shí)用方法。90%以上的WNT型髓母細(xì)胞瘤因?yàn)榇嬖贑TNNB1突變而通過這種方法被檢測(cè)出來，而半數(shù)SHH型腫瘤存在該通路效應(yīng)蛋白編碼基因（如PTCH1、SUFU和SMO）的突變，因此可通過這種方法識(shí)別。然而，該方法不適用于G3型和G4型腫瘤的識(shí)別，因?yàn)樯形磋b定出具有足夠敏感性（<15%）的突變可用于界定這兩個(gè)分子亞型。

基于表達(dá)譜的分子分型方法

能夠以基于腫瘤表達(dá)特征區(qū)分四個(gè)分子亞型的方法，這些表達(dá)模式通過兩種技術(shù)進(jìn)行定量：無擴(kuò)增雜交系統(tǒng)（NanoString）和聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）。

NanoString技術(shù)：基于髓母細(xì)胞瘤的組學(xué)研究，多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)致力于簡(jiǎn)化四個(gè)分子亞型的特征基因集，其中Northcott等人的研究尤為突出，他們定義了包含25個(gè)基因的檢測(cè)組合用于分子分類。該基因組合通過NanoString nCounter平臺(tái)進(jìn)行檢測(cè)，該平臺(tái)基于生物樣本與芯片中熒光標(biāo)記探針的雜交進(jìn)行多重檢測(cè)，無需擴(kuò)增步驟。熒光信號(hào)與檢測(cè)組合中標(biāo)志物的表達(dá)相關(guān)，為每個(gè)分子亞型生成特異性表達(dá)譜。與大規(guī)模分析分類方法相比，NanoString可在90%-98%的患者中鑒定出分子亞型。影響準(zhǔn)確度的因素包括：分析冷凍組織提取的RNA時(shí)，一致性可達(dá)98%；而分析石蠟包埋組織提取的RNA時(shí)，一致性降至67%-87%，且與石蠟包埋樣本的存放時(shí)間相關(guān)。

定量PCR：2020年Cruzeiro等通過Taqman探針陣列和相對(duì)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCRq），對(duì)同一基因組合進(jìn)行了評(píng)估。該策略與大規(guī)模分析結(jié)果的一致性達(dá)97%，其中G3型髓母細(xì)胞瘤的準(zhǔn)確度最低（88.9%）。為降低因使用多種探針的檢測(cè)組合成本，他們將基因數(shù)量限制為6個(gè)，將腫瘤分為三類：WNT型、SHH型和G3/G4型（非WNT/非SHH型）。所有WNT型病例和86%的SHH型病例獲得一致性結(jié)果。方法學(xué)上，qPCR檢測(cè)組合的部分缺點(diǎn)包括：需進(jìn)行多次分析才能確定單個(gè)樣本的分子亞型，實(shí)用性欠佳；此外，還需要高質(zhì)量、足量的樣本（腫瘤RNA）以滿足所有檢測(cè)需求。

基于表觀遺傳的分子分型方法

敏感性和特異性最高的方法是轉(zhuǎn)錄組或表觀基因組水平的大規(guī)模分析，這兩種方法均被視為參考標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用于臨床實(shí)踐和研究方案中。它們的共同優(yōu)勢(shì)在于，部分方法已用于大規(guī)模隊(duì)列分類，這有助于結(jié)果的生物信息學(xué)分析，進(jìn)而促進(jìn)其在新醫(yī)療中心的應(yīng)用。

基于表觀遺傳變化的分子分型：用于髓母細(xì)胞瘤表觀遺傳分析的兩種技術(shù)為微陣列和基因組測(cè)序。技術(shù)層面，通過甲基化譜界定分子亞型的主要優(yōu)勢(shì)在于樣本特性：與RNA相比，DNA更穩(wěn)定。此外，核酸的可及性也是一個(gè)優(yōu)勢(shì)：DNA可從石蠟包埋組織中獲取，而活檢組織石蠟包埋是臨床診斷的常規(guī)步驟；相比之下，獲取高質(zhì)量RNA需要從新鮮組織中提取，但手術(shù)獲得的組織通常立即存放在甲醛中，這會(huì)影響RNA的完整性，因此新鮮組織往往難以獲取。

1.甲基化微陣列：甲基化微陣列分類通過亞硫酸氫鹽處理樣本與針對(duì)特定甲基化易感基因組位點(diǎn)（包括CpG島、基因體、基因間區(qū)域和啟動(dòng)子）設(shè)計(jì)的探針雜交，檢測(cè)甲基化DNA區(qū)域。

髓母細(xì)胞瘤研究中使用了三種Illumina平臺(tái)：GoldenGate Cancer Panel I、450K/EPIC Human Infinium和850K/EPIC Human Infinium芯片，分別可檢測(cè)超過1505個(gè)、45萬個(gè)和85萬個(gè)甲基化位點(diǎn)。在這些平臺(tái)中，450K芯片應(yīng)用最廣泛，可對(duì)95%-100%的受檢患者進(jìn)行分子亞型劃分。2%-4%的患者因樣本量不足無法進(jìn)行分析。

對(duì)比表達(dá)微陣列分類和甲基化表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有WNT型和SHH型病例均具有兩者的相關(guān)性。然而，G3型和G4型中5%的病例存在假陽性。導(dǎo)致結(jié)果不一致的因素可能如Williamson在2022年所描述，包括：兩者分子相似性較高，或它們屬于兩個(gè)分型之間的中間分子譜系。為解決這一差異，結(jié)合其他臨床特征（年齡和性別）和生物學(xué)特征（組織學(xué)類型和基因改變）進(jìn)行補(bǔ)充分析可能有助于明確分子類型。例如，大細(xì)胞組織學(xué)特征和MYC擴(kuò)增在G3型髓母細(xì)胞瘤中占主導(dǎo)地位，但在G4型中罕見；反之，MYCN擴(kuò)增在G4型髓母細(xì)胞瘤中比G3型更常見。

與其他分類方法相比，甲基化微陣列最顯著的優(yōu)勢(shì)在于能夠區(qū)分其他類型腫瘤，如室管膜瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤或星形細(xì)胞瘤，這些腫瘤在組織病理學(xué)上可能被錯(cuò)誤診斷為髓母細(xì)胞瘤，此類情況占患者的比例高達(dá)8%。因此，部分作者將該方法稱為組織學(xué)譜系劃分的金標(biāo)準(zhǔn)。該方法的局限性包括：最常用的平臺(tái)（Illumina，Infinium）需至少同時(shí)處理8個(gè)樣本，這增加了單個(gè)樣本的分析成本，或?qū)е聻槭占銐驑颖疽蕴顫M芯片而延遲檢測(cè)，進(jìn)而阻礙患者的及時(shí)分子診斷和個(gè)性化治療。

2.DNA測(cè)序：獲取甲基化譜的另一種策略是基因組測(cè)序。髓母細(xì)胞瘤研究中使用了兩種平臺(tái)：Illumina和近期的牛津納米孔技術(shù)（ONT）。與甲基化微陣列類似，Illumina測(cè)序需對(duì)腫瘤DNA樣本進(jìn)行亞硫酸氫鈉預(yù)處理，以區(qū)分甲基化堿基。而ONT技術(shù)無需預(yù)先處理，可直接進(jìn)行DNA測(cè)序，消除了亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化導(dǎo)致的降解風(fēng)險(xiǎn)和Illumina文庫構(gòu)建中擴(kuò)增帶來的偏倚。

除甲基化組外，ONT平臺(tái)還可用于研究其他基因組數(shù)據(jù)，如小插入缺失（indels）、結(jié)構(gòu)變異、融合基因、單核苷酸變異（SNVs）和拷貝數(shù)變異（CNVs）。后兩種改變與MYC擴(kuò)增檢測(cè)和TP53突變鑒定相關(guān)，分別是高危G3型髓母細(xì)胞瘤和SHH型髓母細(xì)胞瘤患者的特征。該技術(shù)的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是能夠通過自適應(yīng)采樣對(duì)特定基因組區(qū)域進(jìn)行實(shí)時(shí)測(cè)序，從而無需在文庫制備過程中進(jìn)行額外的富集步驟。這種方法可快速生成分子分類結(jié)果，通常在測(cè)序后數(shù)小時(shí)內(nèi)即可獲得，且與甲基化微陣列結(jié)果的一致性>90%。

甲基化組測(cè)序分類可在高達(dá)98%的患者中鑒定出分子亞型，G3型和G4型之間的誤判率僅為5%。由于這是一種較新的方法，僅在小規(guī)模髓母細(xì)胞瘤患者隊(duì)列中得到驗(yàn)證，且分析方法基于學(xué)習(xí)模型，其結(jié)果可能受樣本量影響。分類模型的準(zhǔn)確度依賴于訓(xùn)練所用的參考數(shù)據(jù)，因此需考慮數(shù)據(jù)集中的樣本數(shù)量以及分類所涉及的類別（分子分型）數(shù)量和命名。這些局限性可通過數(shù)據(jù)共享和類別標(biāo)準(zhǔn)化的協(xié)作過程來彌補(bǔ)。此外，由于髓母細(xì)胞瘤固有的異質(zhì)性，全球人群中很可能會(huì)持續(xù)鑒定出具有中間表型的病例，導(dǎo)致分子分型劃分存在分歧。

3.最小甲基化分類器：基于甲基化模式分類的另一種工具是鑒定包含17個(gè)甲基化區(qū)域（CpG位點(diǎn)）的甲基化組特征，稱為MIMIC（Minimal Methylation Classifier）。該方法的設(shè)計(jì)基于450K/EPIC Human Infinium微陣列數(shù)據(jù)，提取四個(gè)分子亞型中甲基化變異性最大的區(qū)域，并通過Agena iPLEX技術(shù)（基于PCR和質(zhì)譜）進(jìn)行分析。

DNA樣本需預(yù)先進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理以區(qū)分甲基化胞嘧啶，目標(biāo)區(qū)域通過PCR擴(kuò)增后進(jìn)行單核苷酸延伸——甲基化區(qū)域（保留胞嘧啶）會(huì)摻入鳥嘌呤核苷酸，而非甲基化區(qū)域（轉(zhuǎn)化為尿嘧啶）會(huì)摻入胸腺嘧啶核苷酸。最后，通過質(zhì)譜分析擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)分子量確定甲基化狀態(tài)。該方法的準(zhǔn)確度為92%-98%，但由于質(zhì)譜平臺(tái)成本較高，尚未在醫(yī)療中心廣泛應(yīng)用。

基于轉(zhuǎn)錄組的分子分型方法

髓母細(xì)胞瘤的轉(zhuǎn)錄組分析首次揭示了這四個(gè)分子亞型的存在。因此，2011年Northcott發(fā)表研究，確立了髓母細(xì)胞瘤的分子共識(shí)，每個(gè)亞型均根據(jù)其表達(dá)特征命名，缺乏特異性通路的G3型和G4型除外。表達(dá)微陣列分子分類因其高敏感性和特異性，成為首選策略之一。

表達(dá)數(shù)據(jù)微陣列：髓母細(xì)胞瘤四個(gè)分子亞型存在的首個(gè)證據(jù)來自通過HumanGene U133微陣列平臺(tái)（A版和U133 Plus 2.0版）進(jìn)行的表達(dá)譜分析。隨后，其他微陣列如Human Exon 1.0、Human Gene 1.1 ST、Human Gene 2.0 ST和Whole Human Genome 4×44 K）也被用于相關(guān)研究。這些平臺(tái)在陣列密度、識(shí)別的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量和區(qū)域方面存在差異：例如，Human Gene 2.0 ST芯片包含135萬個(gè)探針，可識(shí)別41.8萬個(gè)外顯子和4.8萬個(gè)mRNA 3'區(qū)域標(biāo)志物；而Human Exon 1.0陣列包含約550萬個(gè)探針，分布在超過100萬個(gè)外顯子中，涵蓋2009年記錄的所有轉(zhuǎn)錄本。

然而，無論使用何種陣列類型和結(jié)果解讀的生物信息學(xué)分析方法（主成分分析、非負(fù)矩陣分解或?qū)哟尉垲悾?，所有患者均可被分類，即無模糊病例。因此，該方法被視為髓母細(xì)胞瘤分子分類的金標(biāo)準(zhǔn)，準(zhǔn)確度達(dá)100%。全球最大規(guī)模的隊(duì)列均通過該方法進(jìn)行分類，這為其在新中心的應(yīng)用提供了優(yōu)勢(shì)，有助于分析模型的訓(xùn)練和驗(yàn)證。

同樣，大規(guī)模分析需考慮的方面包括技術(shù)要求和基礎(chǔ)設(shè)施，這是關(guān)鍵因素。微陣列分類至少需要三種高度專業(yè)化的設(shè)備：雜交爐、流體工作站和掃描儀。此外，樣本處理的技術(shù)復(fù)雜性需要訓(xùn)練有素的人員以維持整個(gè)過程中樣本的完整性，同時(shí)需要具備專業(yè)培訓(xùn)的人員進(jìn)行結(jié)果的生物信息學(xué)分析。這對(duì)其在臨床實(shí)踐中的應(yīng)用構(gòu)成了挑戰(zhàn)。

小結(jié)

本綜述旨在為不同資源條件的醫(yī)療中心提供分子分型技術(shù)選擇的參考依據(jù)，幫助其在可及范圍內(nèi)選用適宜的診斷工具。同時(shí)，通過系統(tǒng)評(píng)估現(xiàn)有方法的一致性、可重復(fù)性與誤判風(fēng)險(xiǎn)，呼吁建立多中心標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)流程與質(zhì)控體系，并推動(dòng)低成本、高精度新型技術(shù)的研發(fā)與臨床轉(zhuǎn)化，以期提升髓母細(xì)胞瘤全球范圍內(nèi)的精準(zhǔn)診療水平。

參考文獻(xiàn)：Ramírez-Chiquito JC, Juárez-Méndez S. Strategies for the molecular classification of medulloblastoma.Biomedicines, 2025, 13(12): 2845. DOI:10.3390/biomedicines13122845.

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