引言

抗體偶聯(lián)藥物（ADC）作為一種強大的癌癥治療模式，其成功在很大程度上歸功于連接子系統(tǒng)的發(fā)展，該系統(tǒng)能夠在癌細胞內(nèi)實現(xiàn)細胞毒性載荷藥物的靶向釋放。許多溶酶體蛋白酶在人類癌癥中過度表達，能有效切割多種肽序列，這一特性被用于ADC連接子系統(tǒng)的設(shè)計。其中，纈氨酸-瓜氨酸-對氨基芐基氨基甲酸酯連接子已在許多獲批或處于臨床前和臨床開發(fā)階段的ADC中使用。

盡管ValCit-PABC及其相關(guān)連接子在溶酶體中容易被組織蛋白酶切割，同時在人類血漿中保持相當(dāng)穩(wěn)定，但許多研究表明它們易受小鼠和大鼠血漿中的羧酸酯酶1C的影響，這阻礙了ADC的臨床前評估。此外，ADC最常見的劑量限制性不良反應(yīng)——中性粒細胞減少癥和血小板減少癥，被認為是由人中性粒細胞彈性蛋白酶對ValCit-PABC的過早水解引起的。除了ValCitPABC，GGFG四肽-氨基甲氧基連接子也是組織蛋白酶可切割的，并已用于ADC藥物DS8201a中。除了組織蛋白酶可切割的連接子，豆莢蛋白敏感連接子也日益受到ADC開發(fā)的關(guān)注。提高血漿穩(wěn)定性同時保持ADC連接子的溶酶體可切割性是當(dāng)前深入研究的重點。

一、ADC的作用機制與連接子設(shè)計原理

ADC的作用機制涉及抗體與癌細胞上特定抗原的結(jié)合，隨后通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用內(nèi)化。一旦進入癌細胞，抗體在核內(nèi)體-溶酶體區(qū)室中的降解和/或連接子的切割將釋放藥物載荷，隨后其在細胞質(zhì)或細胞核中發(fā)揮其殺細胞作用。研究人員利用了兩個重要的核內(nèi)體-溶酶體特征來設(shè)計藥物釋放的連接子系統(tǒng)：(i) 溶酶體內(nèi)部的酸性環(huán)境用于設(shè)計酸不穩(wěn)定性連接子，以及 (ii) 特定溶酶體蛋白酶的過度表達用于設(shè)計蛋白酶可切割的連接子。在17種獲批的ADC中，有9種的連接子中含有蛋白酶可識別的肽序列。連接子-載荷優(yōu)化是ADC開發(fā)中最關(guān)鍵的任務(wù)之一。

溶酶體蛋白酶可切割的ValCit-PABC連接子系統(tǒng)在許多已獲批的ADC中使用，其在連接Cit和PABC的酰胺鍵處容易被切割，導(dǎo)致自消除性載荷釋放。最初認為只有組織蛋白酶B負責(zé)切割ValCit-PABC；然而，后來的基因敲除研究表明，其他組織蛋白酶，如組織蛋白酶S、L和F，也參與了切割機制。研究還揭示了多種二肽序列可以作為這些溶酶體酶的底物。在ValCitPABC連接子的初步開發(fā)之后，研究人員已經(jīng)測試了大量的肽/擬肽序列，以進一步改進連接子系統(tǒng)。

ValCit-PABC連接子系統(tǒng)已被證明在人類血清中具有良好的穩(wěn)定性，這是ADC在體循環(huán)中維持酶降解的最重要標準。然而，許多研究表明ValCit-PABC在小鼠血漿中不穩(wěn)定，這種降解是由一種稱為羧酸酯酶C1的蛋白酶引起的。這種不穩(wěn)定性阻礙了ADC的臨床前評估。此外，ADC治療通常會導(dǎo)致癌癥患者中性粒細胞減少。Zhao等人使用純化的中性粒細胞彈性蛋白酶評估了具有可切割纈氨酸-瓜氨酸連接子或不可切割馬來酰亞胺己酰連接子的ADC的體外穩(wěn)定性，結(jié)果表明ValCit連接子容易被彈性蛋白酶切割以釋放游離MMAE，而MC連接子則不能。

二ValCit-PABC連接子的優(yōu)化策略與結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系

1. 在P3位添加極性酸性殘基以增加血漿穩(wěn)定性

ValCit-PABC連接子被設(shè)計為由組織蛋白酶B在連接P1殘基瓜氨酸和P1' PABC的酰胺鍵處切割。組織蛋白酶B是一種主要存在于溶酶體中的半胱氨酸蛋白酶。然而，研究表明ValCit-PABC可以被小鼠血漿中的Ces1C切割。在明確Ces1C介導(dǎo)的切割機制后，作者合成了幾種在P3位具有取代的新型連接子-載荷分子并測試了其穩(wěn)定性。有趣的是，他們觀察到當(dāng)某些親水基團被引入P3位時，小鼠血漿穩(wěn)定性增加；特別是，2-羥基乙酰胺基團極大地提高了血漿穩(wěn)定性。

受這些結(jié)果的啟發(fā)，Anami等人在P3位引入了親水性氨基酸，發(fā)現(xiàn)雖然SerValCit在穩(wěn)定性上改善甚微，但在P3位具有酸性氨基酸的連接子，如GluValCit和AspValCit，在小鼠血漿中表現(xiàn)出優(yōu)異的穩(wěn)定性。相反，在P3位具有堿性氨基酸Lys使LysValCit連接子比母體ValCit連接子更不穩(wěn)定。這表明P3位的酸性氨基酸有效地阻斷了Ces1C的接近，而堿性氨基酸增強了Ces1C與連接子之間的相互作用。重要的是，上述討論的所有連接子-載荷設(shè)計在人類血清中都非常穩(wěn)定，并且它們?nèi)匀粚θ苊阁w酶組織蛋白酶B敏感，這對于癌細胞內(nèi)的藥物釋放至關(guān)重要。

2. P1位極性堿性殘基取代改善溶酶體切割活性

研究人員設(shè)計了大量的P2-P1二肽，通過取代P2-Val和P1-Cit，旨在增加連接子的溶酶體可切割性并改善其在小鼠血漿中的穩(wěn)定性。當(dāng)極性瓜氨酸被丙氨酸取代時，血漿穩(wěn)定性進一步下降，盡管組織蛋白酶B的載荷釋放未受影響。當(dāng)極性帶負電荷的天冬氨酸被引入P1位時，血漿穩(wěn)定性沒有顯著變化；然而，它顯示出組織蛋白酶B的載荷釋放減少。相反，另一項關(guān)于P1氨基酸對組織蛋白酶介導(dǎo)切割影響的研究表明，P1位的精氨酸殘基將切割效率提高了九倍。這些結(jié)果表明，極性或堿性的P1氨基酸對于有效的載荷釋放是可取的，而酸性殘基則會降低切割效率。

3. PABC苯環(huán)上取代的影響

直接將Val-Cit連接到載荷上會導(dǎo)致由于載荷的位阻因素抑制組織蛋白酶與ValCit二肽的結(jié)合，從而導(dǎo)致較低的載荷釋放效率。當(dāng)在載荷和ValCit之間添加間隔基時，這個問題得到部分解決。PABC不僅改善了組織蛋白酶的結(jié)合，而且還經(jīng)歷自消除性1,6-消除以未修飾的形式釋放載荷。目前，PABC與各種載荷和肽連接子系統(tǒng)一起使用。

為了改善ValCit-PABC連接子系統(tǒng)對小鼠血漿中Ces1C的穩(wěn)定性，Podule等人合成了幾種具有PABC上取代或替換的uncialamycin-連接子偶聯(lián)物，包括用噻唑等雜環(huán)替換。在PABC苯環(huán)的間位引入N-甲基羧酰胺基團時獲得了令人鼓舞的結(jié)果。所得的MA-PABC在小鼠血清中僅被切割3%，且其組織蛋白酶介導(dǎo)的釋放未受影響。當(dāng)在相同的MA-PABC的P3位添加谷氨酸時，小鼠血清中的切割在24小時內(nèi)進一步減少至7%。添加谷氨酸不僅改善了對Ces1C的穩(wěn)定性，還改善了溶解度，這在疏水性載荷使用時尤為重要。作者進一步通過用2-氨基乙基及其氨基聚乙二醇化形式替換甲基來增加連接子的親水性。這些新的修飾為連接子提供了優(yōu)異的小鼠和人類血清穩(wěn)定性，且不影響組織蛋白酶B介導(dǎo)的切割。上述研究清楚地表明，結(jié)合結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系研究中的各種屬性可以產(chǎn)生具有高血漿穩(wěn)定性同時保持組織蛋白酶敏感性的理想連接子-載荷系統(tǒng)。

4. 串聯(lián)可切割連接子

ValCit-PABC偶聯(lián)ADC的一個常見缺點是骨髓抑制，這很可能是由連接子的過早切割和載荷釋放引起的。為了改善ValCit-PABC-MMAE偶聯(lián)ADC的體內(nèi)穩(wěn)定性，Chuprakov等人開發(fā)了一種有趣的串聯(lián)可切割連接子。他們在PABC上引入了一個β-葡萄糖醛酸苷部分，作為位阻阻斷劑，以保護ValCit-PABC連接子免受循環(huán)中絲氨酸蛋白酶的影響。內(nèi)化后，β-葡萄糖醛酸糖苷酶介導(dǎo)的β-葡萄糖醛酸苷切割將首先暴露ValCit-PABC，然后其再被組織蛋白酶切割以在癌細胞內(nèi)部釋放MMAE。

所有ADC在體外針對B細胞非霍金淋巴瘤衍生的CD79b+ JeKo-1細胞進行測試時均表現(xiàn)出同等效力。正如預(yù)期，傳統(tǒng)的ValCitPABC-MMAE ADC在大鼠血漿中于37°C孵育一周后損失了20%的載荷，而具有串聯(lián)可切割連接子的ADC未觀察到載荷損失。當(dāng)在攜帶Granta 519異種移植物的小鼠中進行測試時，使用半胱氨酸偶聯(lián)的MC-ValCit-PABC-MMAE與P1' PABC上具有β-葡萄糖醛酸苷部分的ADC在減少腫瘤體積方面表現(xiàn)出幾乎同等的效力。

臨床化學(xué)和血液學(xué)在第5天和第7天進行評估。研究了骨髓抑制的關(guān)鍵指標，即單核細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞的水平。用傳統(tǒng)的單切割連接子ADC治療的大鼠的循環(huán)單核細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞水平顯著降低，而用串聯(lián)切割連接子ADC治療的大鼠未顯示任何骨髓抑制證據(jù)。事實上，后一組循環(huán)單核細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞的水平與媒介物對照組相似，這清楚地表明在P1'位用β-葡萄糖醛酸苷部分掩蔽極大地增加了連接子在循環(huán)中的穩(wěn)定性。

除了血漿不穩(wěn)定性，二肽基連接子通常具有疏水性，可能導(dǎo)致ADC聚集。為了應(yīng)對這些問題，Bargh等人報道了一種雙酶可切割的3-O-磺基-β-半乳糖連接子，可以通過芳基硫酸酯酶A和β-半乳糖苷酶的連續(xù)作用以級聯(lián)反應(yīng)切割。ARSA/β-半乳糖苷酶組合極大地改善了溶酶體選擇性切割。此外，陰離子硫酸基團和半乳糖部分的存在極大地改善了連接子在水介質(zhì)中的溶解度。3-O-磺基-β-半乳糖連接子系統(tǒng)可用于生成具有高度疏水性載荷的ADC，這些載荷在水介質(zhì)中容易聚集。

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三、GGFG四肽與豆莢蛋白敏感連接子

1. GGFG四肽-氨基甲氧基連接子

除了流行的肽-PABC系統(tǒng)，另一種肽連接子，包含用于自消除性藥物釋放的氨基甲氧基，已成功用于DS8201的開發(fā)。1995年，Nogusa等人通過將其氨基基團連接到羧甲基支鏈淀粉上制備了阿霉素的偶聯(lián)物。他們證明，當(dāng)在藥物和多糖聚合物之間放置四肽間隔GGFG時，溶酶體酶有效地釋放了游離阿霉素。當(dāng)肽間隔是GFGG時，阿霉素仍可被釋放，但程度遠低于GGFG間隔。沒有肽間隔的偶聯(lián)物沒有檢測到藥物釋放。他們還表明，偶聯(lián)物的抗腫瘤活性與連接子的可切割性平行，GGFG偶聯(lián)物活性最高，無間隔基偶聯(lián)物活性最低。

在2007年發(fā)表的一項研究中，Shiose等人報道了DX8951的大分子前藥，其中聚合物載體羧甲基葡聚糖多元醇通過GGFG四肽間隔基在其氨基基團上與依沙替康偶聯(lián)。研究發(fā)現(xiàn)，來自溶酶體的組織蛋白酶B、H和L能夠切割甘氨酰-依沙替康酰胺鍵以釋放游離依沙替康。在此基礎(chǔ)上，Ogitani等人開發(fā)了一種靶向Her-2的ADC，即DS8201a，以DXd作為載荷。

DS8201a使用半胱氨酸-馬來酰亞胺化學(xué)制備，理論DAR為8。DXd中的羥基被用于通過馬來酰亞胺官能化的GGFG-氨基甲氧基連接子進行抗體偶聯(lián)。ADC內(nèi)化后，組織蛋白酶切割GGFG的C端甘氨酸與氨基甲氧基之間的酰胺鍵，觸發(fā)后者分解以釋放游離DXd。DS8201a在小鼠、大鼠或人類血漿中表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，在21天內(nèi)僅釋放1-2%的載荷。在后續(xù)研究中，Ogitani等人發(fā)現(xiàn)DS8201a表現(xiàn)出優(yōu)異的旁觀者效應(yīng)，因為依沙替康中的游離胺被羥基乙?；忾]，DXd載荷不能被質(zhì)子化電離，因此具有高膜滲透性。DS8201a還被發(fā)現(xiàn)是一種非常有效的ADC，針對Her-2低表達的癌癥，這主要歸因于其高DAR為8以及DXd通過細胞膜擴散并殺死附近癌細胞的旁觀者效應(yīng)。

2. 豆莢蛋白敏感連接子

豆莢蛋白敏感連接子是一類利用豆莢蛋白酶特異性切割的肽序列，將抗體與細胞毒性藥物連接起來的ADC連接子設(shè)計。豆莢蛋白是一種在癌細胞中高表達、并在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用的天冬酰胺內(nèi)肽酶，主要存在于溶酶體中。其過度表達的特性使其成為設(shè)計蛋白酶可切割連接子的有吸引力的靶點。

在設(shè)計上，這類連接子通常包含能被豆莢蛋白特異性識別的肽序列（例如含有天冬酰胺的序列），并在其基礎(chǔ)上結(jié)合自消除間隔基（如PABC），以實現(xiàn)細胞內(nèi)的高效藥物釋放。研究已證實，含有AlaAlaAsn等序列的連接子可被豆莢蛋白有效切割，從而作為前藥釋放活性載荷。通過高通量篩選等方法，研究人員還發(fā)現(xiàn)了其他Asn相關(guān)的二肽序列（如AsnAsn、AsnAla等）對豆莢蛋白具有選擇性，并且在小鼠血漿中表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。與傳統(tǒng)的組織蛋白酶可切割連接子相比，豆莢蛋白敏感連接子旨在提供另一種具有潛在更高腫瘤選擇性的裂解機制。

當(dāng)前，這類連接子正受到ADC開發(fā)領(lǐng)域日益增長的關(guān)注，是連接子技術(shù)多樣化發(fā)展的重要方向之一。

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結(jié)語

溶酶體可切割肽連接子是ADC技術(shù)發(fā)展的核心組成部分，其設(shè)計優(yōu)化直接關(guān)系到藥物的療效、安全性與治療窗口。從經(jīng)典的ValCitPABC到新興的串聯(lián)可切割連接子、GGFG四肽系統(tǒng)以及對豆莢蛋白敏感連接子的探索，該領(lǐng)域的研究始終圍繞著提高血漿穩(wěn)定性與增強溶酶體特異性切割效率這兩個核心目標展開。通過理性設(shè)計，如在P3位引入酸性氨基酸、優(yōu)化P1位殘基、對PABC苯環(huán)進行親水性修飾等策略，已經(jīng)顯著改善了連接子的性能。未來，隨著對溶酶體蛋白酶生物學(xué)理解的加深以及新的工程化策略（如條件性激活連接子）的出現(xiàn)，ADC連接子將繼續(xù)朝著更精準、更安全、更有效的方向發(fā)展，從而為癌癥患者帶來更多獲益。

參考資料：

1.Lysosomal-Cleavable Peptide Linkers in Antibody-Drug Conjugates. Biomedicines. 2023 Nov 16;11(11):3080.

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