姜黃素（Cur）是從姜黃根莖中提取出的一種天然多酚類化合物，具有抗氧化、抗炎等多種生物活性。然而，Cur水溶性差且在消化過程中容易被酶降解，口服Cur有60%的劑量被吸收，但其在腦部積累量仍不足以發(fā)揮其最佳活性，表現(xiàn)出較低的生物可及性。目前，穩(wěn)態(tài)化遞送體系已被廣泛開發(fā)，包括天然大分子（蛋白質(zhì)或多糖）、脂質(zhì)體和食源性胞外囊泡等，它們具有較高的比表面積和表面電荷量、可與配體結(jié)合等方面的優(yōu)勢(shì)，為定向輸送功能因子提供了有利條件。

果蔬來源外泌體樣囊泡（ELNs）作為納米級(jí)囊泡，在生理環(huán)境下具有尺寸效應(yīng)，類似脂質(zhì)體，內(nèi)含核酸和蛋白質(zhì)及次級(jí)代謝產(chǎn)物，在細(xì)胞間具有天然的通信功能。ELNs作為遞送載體，有助于提高功能因子的生物利用度，增強(qiáng)其營養(yǎng)價(jià)值。

菠菜（

Spinacia oleracea

南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院的張梓文、倪露源、朱珍珠* 擬從菠菜中提取SL-ELNs并對(duì)其結(jié)構(gòu)和成分進(jìn)行表征。以SL-ELNs為壁材，裝載Cur，制備Cur@SL-ELNs，檢測(cè)其在體外消化模擬液中釋放Cur的情況，探究Cur@SL-ELNs的自適應(yīng)表面特性。采用小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞（BV-2）評(píng)估Cur@SL-ELNs細(xì)胞攝取能力及其對(duì)BV-2細(xì)胞增殖的影響。通過脂多糖（LPS）誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞損傷，比較Cur@SL-ELNs和Cur對(duì)細(xì)胞因子分泌水平的影響，探究SL-ELNs對(duì)姜黃素的生物可及性和抗炎活性的影響。

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SL-ELNs和Cur@SL-ELNs的表征

本研究采用高速離心和超濾相結(jié)合的方法，成功從菠菜中提取SL-ELNs（圖1A）。經(jīng)測(cè)定，每千克菠菜可提取12.4 g SL-ELNs凍干粉，其中100 mg SL-ELNs中蛋白質(zhì)含量為3.6 mg、脂質(zhì)含量為0.6 mg、核酸含量為18 μg。NTA數(shù)據(jù)顯示，上機(jī)樣品中SL-ELNs粒子濃度為7.6×107個(gè)/mL，粒徑呈正態(tài)分布（圖1B）。SL-ELNs原始溶液中，粒子濃度為1.52×109個(gè)/mL，蛋白質(zhì)量濃度為1.8 mg/mL，則純度為8.44×108個(gè)/mg蛋白。這與本課題組前期采用超速離心結(jié)合蔗糖密度梯度法提取的大蒜ELNs純度（2.27×108 個(gè)/mg蛋白）相當(dāng)。本實(shí)驗(yàn)中，SL-ELNs的平均粒徑為146.8 nm；文獻(xiàn)報(bào)道，采用尺寸排阻色譜法提取的SL-ELNs平均粒徑為135.6 nm，說明不同提取方法得到的ELNs粒徑略有差異。TEM圖片顯示，SL-ELNs為杯狀囊泡，具有雙層膜結(jié)構(gòu)（圖1C）。

Cur為脂溶性分子，與SL-ELNs的雙層膜結(jié)構(gòu)具有相容性，故將Cur與SL-ELNs共孵育，并加入皂苷，使Cur裝載到SL-ELNs中，制備Cur@SL-ELNs（圖1A）。為了考察Cur在SL-ELNs中的包封率，采用HPLC檢測(cè)透析液和超濾收集的濾液中游離的Cur含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，透析24 h后，游離Cur的信號(hào)峰均在HPLC的檢測(cè)限以下，說明透析液中游離的Cur極少，Cur有可能被囊泡完全包埋。為了驗(yàn)證這個(gè)結(jié)果，將透析24 h后透析袋內(nèi)的溶液進(jìn)行多次超濾，取濾液進(jìn)行HPLC檢測(cè)。結(jié)果證實(shí)，超濾后游離的Cur信號(hào)微弱。因此，認(rèn)為Cur完全被SL-ELNs包埋，包封率接近100%。已有研究表明，番茄來源ELNs負(fù)載Cur的包封率為0.22%，當(dāng)ELNs（以蛋白含量計(jì)）與Cur投料比為1∶5時(shí)，SL-ELNs裝載Cur具有更優(yōu)的包封效率，這可能與ELNs的來源差異有關(guān)。NTA數(shù)據(jù)顯示，裝載Cur后，Cur@SL-ELNs的粒子濃度為7.1×107個(gè)/mL，平均粒徑為161.9 nm（圖1D）。與SL-ELNs相比，Cur@SL-ELNs平均粒徑增加了15.1 nm。同時(shí)，Cur@SL-ELNs粒子仍然保持囊泡結(jié)構(gòu)（圖1E）。

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Cur@SL-ELNs在體外消化模擬液中可緩慢釋放Cur

為了考察Cur@SL-ELNs在消化液中囊泡發(fā)生的變化及Cur釋放能力，采用體外消化模擬實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估。如圖2A、B所示，消化前，Cur@SL-ELNs的水合粒徑為（191.7±9.2）nm，Zeta電位為-（8.8±0.9）mV。經(jīng)口腔消化液后，水合粒徑與Zeta電位無顯著性變化。Cur@SL-ELNs經(jīng)胃液消化2 h后，水合粒徑增加為（226.9±14.6）nm，Zeta電位為-（6.5±0.3）mV，電位絕對(duì)值有所降低。Cur@SL-ELNs經(jīng)腸液消化2 h后，水合粒徑為（250.4±18.3）nm，Zeta電位為-（17.4±0.6）mV，囊泡可能發(fā)生聚集。在胃腸消化液作用下中，Cur@SL-ELNs水合粒徑的增加，Zeta電位絕對(duì)值增加可能是顆粒表面與消化酶發(fā)生靜電作用或疏水相互作用所致，這與Jiang Dan等發(fā)現(xiàn)的裝載木犀草素的芝麻葉來源ELNs在模擬胃消化過程變化規(guī)律類似。HPLC檢測(cè)了胃腸消化階段樣品中釋放Cur的信號(hào)，如圖2C所示，在胃消化2 h后，可檢測(cè)到Cur的信號(hào)峰，但是Cur釋放量較低；在腸消化階段，消化2 h，Cur累計(jì)釋放量達(dá)（30.6±3.8）mg，根據(jù)生物可及性的計(jì)算公式可得，SL-ELNs包載Cur后，Cur的生物可及性達(dá)（30.6±3.8）%。文獻(xiàn)中游離Cur的生物可及性只有（0.24±0.01）%。消化10 h時(shí)，Cur的信號(hào)峰最強(qiáng)，釋放Cur最多，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，每個(gè)時(shí)刻釋放的Cur逐漸減少，但是Cur釋放的總量呈上升趨勢(shì)（圖2D）。腸消化24 h后，Cur的釋放量達(dá)到（92.1±4.1）mg。以上結(jié)果說明，Cur@SL-ELNs在口腔和胃酸環(huán)境下保持囊泡結(jié)構(gòu)，到達(dá)腸液消化階段才開始大量釋放Cur分子，釋放率為（92.1±4.1）%，且表現(xiàn)出持續(xù)釋放特性，有助于提高Cur生物可及性和生物活性。

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Cur@SL-ELNs具有良好的自適應(yīng)表面特性

外泌體在進(jìn)入消化系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)時(shí)，可對(duì)受體細(xì)胞產(chǎn)生特異的生物學(xué)效應(yīng)，表現(xiàn)出自適應(yīng)表面特性。納米囊泡的粒徑和電位隨pH值的改變、RB吸附能力和黏蛋白親和力可反映納米囊泡在不同環(huán)境下表面性質(zhì)的變化趨勢(shì)。本研究發(fā)現(xiàn)，在中性環(huán)境下，Cur@SL-ELNs的水合粒徑趨于穩(wěn)定，變化不大；在弱酸條件下，Cur@SL-ELNs的水合粒徑呈現(xiàn)出減小的趨勢(shì)，說明Cur@SLELNs能夠隨著環(huán)境變化調(diào)節(jié)自身與周圍水分子形成的顆粒大小（圖3A）。在同一時(shí)刻下，Cur@SL-ELNs的Zeta電位隨pH值減小而減小，說明Cur@SL-ELNs在偏酸溶液中穩(wěn)定性較好（圖3B）。采用RB吸附法評(píng)價(jià)Cur@SLELNs在弱酸性環(huán)境下表面疏水性，當(dāng)納米囊泡與RB的結(jié)合常數(shù)K增加時(shí)，其表面疏水性增大。然而，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，結(jié)合常數(shù)K值無明顯變化，表明Cur@SLELNs在弱酸性環(huán)境下表面疏水性比較穩(wěn)定（圖3D）。采用黏蛋白親和實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)Cur@SL-ELNs的表面親水性，在pH 5.5、6.0、6.8時(shí)，Cur@SL-ELNs表現(xiàn)出更強(qiáng)的疏水性，導(dǎo)致黏蛋白聚集程度顯著增加；而在pH 7.4時(shí)，Cur@SL-ELNs對(duì)黏蛋白表現(xiàn)出良好的抗性，黏蛋白聚集程度低（圖3C）。結(jié)果表明，Cur@SL-ELNs在消化環(huán)境中可調(diào)整表面結(jié)構(gòu)以適應(yīng)環(huán)境的變化，具有良好的自適應(yīng)表面特性。已有研究證實(shí)，西瓜來源ELNs在不同pH值環(huán)境下可通過其脂質(zhì)層結(jié)構(gòu)的調(diào)整保持穩(wěn)定。在酸性環(huán)境中ELNs的雙層結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出適應(yīng)性；檸檬來源ELNs的表面富含糖蛋白，能調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，適用于過敏反應(yīng)和自身免疫性疾病的緩解。因此，可以推測(cè)Cur@SLELNs具有的自適應(yīng)表面特性與SL-ELNs的雙層膜及膜蛋白有關(guān)，這一特性將有利于其被細(xì)胞攝取。

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Cur@SL-ELNs被BV-2細(xì)胞攝取的情況

為了探究Cur@SL-ELNs能否被BV-2細(xì)胞攝取，采用PKH67對(duì)Cur@SL-ELNs進(jìn)行標(biāo)記，采用DAPI定位細(xì)胞核，通過熒光強(qiáng)度的變化監(jiān)測(cè)Cur@SL-ELNs隨著時(shí)間變化進(jìn)入BV-2細(xì)胞的能力。如圖4A所示，當(dāng)PKH67標(biāo)記的Cur@SL-ELNs加入細(xì)胞2 h后，Cur@SL-ELNs囊泡有一部分開始進(jìn)入細(xì)胞，使細(xì)胞中呈現(xiàn)微弱的綠色熒光（強(qiáng)度為8.06±1.64）。隨著孵育時(shí)間延長(zhǎng)到6 h，細(xì)胞內(nèi)綠色熒光逐漸增強(qiáng)（強(qiáng)度為18.29±2.19）。繼續(xù)延長(zhǎng)孵育時(shí)間，綠色熒光強(qiáng)度無顯著性變化（圖4B）。由此可知，Cur@SLELNs在6 h時(shí)被BV-2細(xì)胞攝取的量達(dá)到飽和。已有研究表明，隨時(shí)間延長(zhǎng)，香菇來源ELNs被Caco-2細(xì)胞攝取的量增加。本實(shí)驗(yàn)與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果類似，說明SL-ELNs的囊泡結(jié)構(gòu)有利于遞送更多的Cur進(jìn)入細(xì)胞，發(fā)揮活性。

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Cur@SL-ELNs對(duì)BV-2細(xì)胞增殖的影響

為了評(píng)估Cur@SL-ELNs對(duì)神經(jīng)損傷的影響，采用小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞（BV-2）進(jìn)行活性評(píng)價(jià)。由圖5A可知，隨著Cur質(zhì)量濃度的增加，BV-2細(xì)胞存活率增加，則Cur可促進(jìn)BV-2細(xì)胞生長(zhǎng)。如圖5B所示，與空白組相比，Cur@SL-ELNs在0～400 ng/mL劑量范圍內(nèi)對(duì)BV-2細(xì)胞的存活率無顯著影響，說明Cur@SL-ELNs的生物相容性良好。然后，本實(shí)驗(yàn)使用LPS誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞模擬神經(jīng)細(xì)胞炎癥損傷，探究Cur@SL-ELNs對(duì)LPS誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞的存活率的影響。如圖5C所示，與空白組相比，LPS組細(xì)胞存活率只有70%。Cur@SL-ELNs預(yù)處理細(xì)胞后，25 ng/mL的Cur@SL-ELNs即可恢復(fù)細(xì)胞的存活率接近100%；隨著Cur@SL-ELNs質(zhì)量濃度增加，細(xì)胞存活率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；當(dāng)Cur@SL-ELNs質(zhì)量濃度大于200 ng/mL時(shí)，細(xì)胞存活率有所下降，但是仍大于100%。說明Cur@SL-ELNs在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)可降低LPS對(duì)BV-2細(xì)胞產(chǎn)生的損傷，促進(jìn)細(xì)胞正常生長(zhǎng)，這可能是Cur在起作用。

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Cur@SL-ELNs對(duì)LPS誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞炎性細(xì)胞因子分泌的影響

LPS刺激細(xì)胞后，細(xì)胞大量分泌IL-6和IFN-γ等促炎因子。由圖6A、B可知，LPS組細(xì)胞中IL-6、IFN-γ的分泌量明顯高于空白組的分泌量。與LPS組相比，Cur@SLELNs和Cur預(yù)處理均可以顯著抑制細(xì)胞中IL-6和IFN-γ的過量分泌，并呈現(xiàn)劑量依賴性。IL-10是細(xì)胞應(yīng)對(duì)炎癥時(shí)產(chǎn)生的一種抗炎細(xì)胞因子，在LPS誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞炎癥模型中，IL-10的分泌量明顯減少。當(dāng)Cur@SL-ELNs和Cur劑量為25、50、100 ng/mL時(shí)均能顯著上調(diào)IL-10的分泌水平（圖6C）。值得注意的是，當(dāng)劑量為100 ng/mL時(shí)，Cur@SL-ELNs作用后細(xì)胞分泌的抗炎因子IL-10水平顯著高于Cur單獨(dú)作用于細(xì)胞分泌的IL-10水平。結(jié)果表明，Cur@SL-ELNs可抑制BV-2細(xì)胞促炎因子的過量分泌，上調(diào)抗炎因子的分泌量，對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥損傷發(fā)揮保護(hù)作用，可緩解神經(jīng)細(xì)胞炎癥。

相比于文獻(xiàn)中使用的質(zhì)量濃度，本研究Cur@SLELNs或Cur所使用的質(zhì)量濃度小2～3 個(gè)數(shù)量級(jí)。由于SL-ELNs在酸性環(huán)境下結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，SL-ELNs包封Cur后，可規(guī)避胃酸環(huán)境，將有助于增加Cur在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的累計(jì)濃度。當(dāng)Cur@SL-ELNs經(jīng)過消化系統(tǒng)到達(dá)遠(yuǎn)端組織，被BV-2細(xì)胞大量攝取后，釋放出來Cur，一方面可通過上調(diào)抗氧化酶活性、清除自由基增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞的抗氧化能力；另一方面，Cur通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞過度激活，減少促炎因子釋放，降低氧化應(yīng)激和炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，阻斷炎癥相關(guān)信號(hào)通路，保護(hù)神經(jīng)元免受損傷。除此之外，作為載體的SL-ELNs，本身攜帶的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸，也有可能發(fā)揮一定的協(xié)同作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，人乳來源外泌體通過抑制LPS誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞中的免疫反應(yīng)信號(hào)通路減少促炎介質(zhì)的產(chǎn)生。本團(tuán)隊(duì)后續(xù)將對(duì)Cur@SL-ELNs調(diào)控BV-2細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)和潛在的分子機(jī)制進(jìn)行深入研究。

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結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)分離純化得到的SL-ELNs是天然的納米級(jí)囊泡，以SL-ELNs為壁材裝載Cur，成功制備了Cur@SLELNs。Cur@SL-ELNs在口腔和胃液中囊泡結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，腸液中破裂，緩慢釋放Cur，其有效減弱了消化道不良環(huán)境影響。同時(shí)，Cur@SL-ELNs在不同pH值環(huán)境中能夠調(diào)節(jié)其表面特性，具有高效的黏液滲透性，有利于受體細(xì)胞的高效攝取，促使更多的Cur在細(xì)胞中積累，從而對(duì)受體細(xì)胞產(chǎn)生特異的生物學(xué)效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Cur@SL-ELNs在較低劑量時(shí)可降低LPS對(duì)BV-2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，上調(diào)抗炎因子分泌水平，發(fā)揮抗炎活性，緩解神經(jīng)炎癥損傷。因此，SL-ELNs的囊泡結(jié)構(gòu)及其自適應(yīng)表面特性協(xié)助Cur克服生理屏障，實(shí)現(xiàn)了Cur的穩(wěn)態(tài)化遞送，提高其生物利用度，增強(qiáng)其生物學(xué)效應(yīng)。本研究證實(shí)了果蔬來源ELNs作為功能因子遞送載體的可行性，將為具有神經(jīng)保護(hù)功能的功能食品研發(fā)提供新的解決方案。

本文《載姜黃素菠菜外泌體樣囊泡的制備及其緩解神經(jīng)炎癥損傷作用》來源于《食品科學(xué)》2025年46卷第19期158-166頁，作者：張梓文，倪露源，朱珍珠。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250402-017。點(diǎn)擊下方閱讀原文即可查看文章相關(guān)信息。

實(shí)習(xí)編輯：楊倩；責(zé)任編輯：張睿梅。點(diǎn)擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網(wǎng)