中文摘要

目的建立并驗證檢測阿達木單抗電荷變異體的陽離子交換高效液相色譜法。

方法采用以羧基官能團的弱陽離子為固定相的交換柱（4 mm×250 mm），以0.01 mol/L 磷酸氫二鈉溶液、pH 7.5為流動相 A，以0.01 mol/L 磷酸氫二鈉+0.5 mol/L 氯化鈉溶液、pH 5.5為流動相 B進行梯度洗脫。按面積歸一法計算賴氨酸變異體和酸性組分含量，并對該方法進行專屬性、重復性、中間精密度、線性、準確度和耐用性驗證。

結果該方法檢測阿達木單抗注射液可見溶劑峰和目標峰；重復檢測6次各組分相對標準偏差均＜2%；不同實驗員、不同實驗設備檢測各組分的相對標準偏差均＜2%；賴氨酸變異體之間的峰的定量限（信噪比＞10）為100 μg/mL、檢測限（信噪比＞3）為30 μg/mL；在企業(yè)質量標準限度范圍內(nèi)檢測不同濃度各組分線性良好，決定系數(shù)均＞0.99；第1酸區(qū)峰、賴氨酸變異體之間的峰和賴氨酸變異體2峰準確度回收率均在80%～115%，第2酸區(qū)峰、主峰和賴氨酸變異體1峰準確度回收率均在85%～110%；不同流動相pH、不同流動相氯化鈉濃度、不同流速與柱溫、不同批次色譜柱條件下檢測結果符合要求，一致性較好。

結論建立的方法具有良好的專屬性、重復性、中間精密度、線性、準確度和耐用性，適用于阿達木單抗電荷變異體的測定。

正文

全人源重組單克隆抗體（單抗）阿達木單抗具有高親和力，是針對TNF-α靶點的生物抑制劑。阿達木單抗在哺乳動物細胞表達與純化過程中，因N-糖基化、氨基酸翻譯后修飾和空間構象的改變，會產(chǎn)生電荷異質性，影響單抗的有效性和穩(wěn)定性。基于電荷差異的離子交換色譜、等電聚焦和毛細管電泳等是檢測抗體等電點變化的常用手段。其中，陽離子交換色譜（cation exchange chromatography，CEX）可有效分離酸性變體、主峰（C末端賴氨酸被完全切除）和堿性變體。酸性物質分為第1酸區(qū)（唾液酸化修飾）和第2酸區(qū)（脫酰胺化、氧化或不同位點的唾液酸化），在主峰前洗脫分離；堿性物質分為賴氨酸變異體1（C末端保留1個賴氨酸）、賴氨酸變異體2（C末端保留2個賴氨酸）及賴氨酸變異體之間的峰，均在主峰后洗脫分離。本研究擬建立CEX法對武漢生物制品研究所有限責任公司（武漢公司）研發(fā)的阿達木單抗電荷變異體進行分析，并對該方法進行驗證。

1

材料與方法

1.1

阿達木單抗參比品

阿達木單抗參比品由武漢公司抗體研究室提供，制備方法與阿達木單抗注射液制備方法一致。重復性、精密度、定量限和檢測限驗證使用50 ℃放置5 d的參比品，耐用性驗證使用未處理參比品。

1.2

供試品

阿達木單抗注射液原液和阿達木單抗注射液由武漢公司抗體研究室提供，第1酸區(qū)峰、第2酸區(qū)峰、主峰、賴氨酸變異體1峰、賴氨酸變異體之間的峰和賴氨酸變異體2峰由武漢公司抗體研究室將阿達木單抗參比品通過液相法和餾分收集器分離并進一步超濾純化制備。

1.3

主要試劑及儀器

無水Na2HPO4購自美國Sigma-Aldrich公司，NaCl和水系0.45 μm濾膜購自國藥集團化學試劑有限公司，ProPacTM WCX-10色譜柱（4 mm×250 mm）購自美國Thermo Fisher公司，Waters e2695高效液相色譜儀、2489 UV紫外檢測器和液相進樣瓶購自美國Waters公司。

1.4

試劑配制

流動相A（0.01 mol/L Na2HPO4，pH7.5）：稱取無水Na2HPO4加超純水溶解，調(diào)pH值至7.5；流動相B（0.01 mol/L Na2HPO4+0.5 mol/L NaCl，pH5.5）：稱取無水Na2HPO4和NaCl加超純水溶解，調(diào)pH值至5.5；阿達木單抗參比品、阿達木單抗注射液、阿達木單抗注射液原液、第1酸區(qū)峰、第2酸區(qū)峰、主峰、賴氨酸變異體1、賴氨酸變異體之間的峰和賴氨酸變異體2等供試品用超純水稀釋至蛋白濃度1 mg/mL。

1.5

色譜條件

流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長280 nm，上樣量100 μL。流動相為A和B組成的二元流動相體系（即以下流動相A＜100%用B補足），洗脫方式為梯度洗脫。洗脫程序為0.0~2.0 min，94%流動相A；2.0~22.0 min，94% ~76%流動相A；22.0~24.0 min，76%~0%流動相A；24.0 ~ 27.0 min，0%流動相A；27.0 ~ 27.1 min，94%流動相A；27.1 ~ 40.0 min，94%流動相A。

1.6

方法驗證

1.6.1　專屬性分別取阿達木單抗注射液制劑緩沖液和阿達木單抗注射液按照1.5項進行檢測分析。阿達木單抗注射液制劑緩沖液應僅有溶劑峰；阿達木單抗注射液除溶劑峰外應有目標峰。

1.6.2　重復性取阿達木單抗參比品在同一時間按照1.5項重復檢測6次各峰面積，計算面積百分比的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。第1酸區(qū)峰的RSD應≤6%；第2酸區(qū)峰的RSD應≤4%；賴氨酸變體總量（主峰、賴氨酸變異體1峰和賴氨酸變異體2峰之和）的RSD應≤4%；賴氨酸變異體之間的峰的RSD應≤6%。

1.6.3　中間精密度取阿達木單抗參比品，由2名實驗員按照1.5項進行測定，各重復檢測6次，計算不同實驗員測定結果的RSD，第1酸區(qū)峰的RSD應≤6%；第2酸區(qū)峰的RSD應≤4%；賴氨酸變體總量的RSD應≤4%；賴氨酸變異體之間的峰的RSD應≤6%。

取阿達木單抗參比品，由1名實驗員在不同設備按照1.5項進行測定，重復檢測6次，計算不同設備測定結果的RSD，第1酸區(qū)峰的RSD應≤6%；第2酸區(qū)峰的RSD應≤4%；賴氨酸變體總量的RSD應≤4%；賴氨酸變異體之間的峰的RSD應≤6%。

1.6.4　定量限和檢測限由于阿達木單抗注射液各組分中，賴氨酸變異體之間的峰含量最小，因此以賴氨酸變異體之間的峰信噪比不小于10和3所對應的濃度為定量限和檢測限。將阿達木單抗參比品稀釋至10~1 000 μg/mL，按照1.5項進行測定，確定定量限和檢測限。對定量限和檢測限濃度重復檢測6次，計算其峰面積RSD，應分別≤10%和20%。

1.6.5　線性和范圍根據(jù)第1酸區(qū)峰、第2酸區(qū)峰、主峰、賴氨酸變異體1峰、賴氨酸變異體之間的峰和賴氨酸變異體2峰的蛋白純度和濃度分別配制上述各峰的供試品溶液，要求各峰峰面積百分比范圍分別為2.0%~10.0%、8.0%~32.0%、52.0%~78.0%、16.0%~24.0%、1.0%~5.0%、3.0%~7.0%。按照1.5項進行測定，以供試品溶液各峰面積百分比理論值為橫坐標、供試品各峰峰面積為縱坐標進行線性擬合，重復3次，得到不同線性方程和決定系數(shù)（R2），R2應不小于0.98。

1.6.6　準確度用線性確認中配制的6個供試品溶液實測的相對百分含量結果比相對百分含量理論值，計算其回收率，第1酸區(qū)峰、賴氨酸變異體之間的峰和賴氨酸變異體2峰回收率應在80%～115%范圍內(nèi)，第2酸區(qū)峰、主峰和賴氨酸變異體1峰回收率應在85%～110%范圍內(nèi)。

1.6.7　耐用性（1）配制pH7.48、7.50、7.52的流動相A與pH5.48、5.50、5.52的流動相B，進行以下組合：第1組，A（pH7.50）和B（pH5.50）；第2組，A（pH7.48）和B（pH5.50）；第3組，A（pH7.52）和B（pH5.50）；第4組，A（pH7.50）和B（pH5.48）；第5組，A（pH7.50）和（pH5.52）。（2）配制NaCl濃度為0.498、0.500、0.502 mol/L的流動相B。（3）設置不同柱溫為29、30、31 ℃；不同流速為0.99、1.00、1.01 mL/min。（4）使用3個不同批號的色譜柱。按照1.5項進行測定，重復檢測3次，計算面積百分比RSD，酸區(qū)峰RSD應≤4%，賴氨酸變異體總量RSD應≤4%，賴氨酸變異體1和2之間的峰RSD應≤6%。

1.7

方法的應用

用該方法檢測武漢公司抗體研究室生產(chǎn)的阿達木單抗注射液原液和阿達木單抗注射液成品。

2

結果

2.1

專屬性

制劑緩沖液有溶劑峰，未出現(xiàn)目標峰；阿達木單抗注射液除溶劑峰外，出現(xiàn)目標峰，見圖1。

2.2

重復性

取阿達木單抗參比品重復檢測6次，第1酸區(qū)、第2酸區(qū)、賴氨酸變體總量、賴氨酸變異體之間的峰面積百分比的RSD分別為0.94%、0.19%、0.04%、0.57%，見表1。

2.3

中間精密度

不同實驗員對阿達木單抗參比品重復檢測6次，第1酸區(qū)、第2酸區(qū)、賴氨酸變體總量、賴氨酸變異體之間的峰面積百分比的RSD分別為1.42%、0.27%、0.12%、0.87%。結果見表2。

同一實驗員在不同設備對阿達木單抗參比品重復檢測6次，第1酸區(qū)、第2酸區(qū)、賴氨酸變體總量、賴氨酸變異體之間的峰面積百分比的RSD分別為0.75%、0.46%、0.17%、1.28%。結果見表3。

2.4

定量限和檢測限

以賴氨酸變異體之間的峰信噪比≥10時樣品濃度（100 μg/mL）為定量限，定量限檢測值為0.332%，重復檢測6次峰面積RSD為4.99%，對應的信噪比分別為12.8、12.3、11.5、11.6、11.3、12.3；以賴氨酸變異體之間的峰信噪比≥3時樣品濃度（30 μg/mL）為檢測限，檢測限檢測值為0.099 6%，重復檢測6次峰面積RSD為3.42%，對應的信噪比分別為3.3、3.2、3.1、3.2、3.1、3.0。結果見表4。

2.5

線性和范圍

第1酸區(qū)、第2酸區(qū)、主峰、賴氨酸變異體1、賴氨酸變異體之間的峰、賴氨酸變異體2峰面積百分比分別在2.0%~10.0%、8.0%~32.0%、52.0%~78.0%、16.0%~24.0%、1.0%~5.0%、3.0%~7.0%范圍內(nèi)檢測各組分線性良好，R2均大于0.99。結果見圖2。

2.6

準確度

線性確認中配制的6個供試品溶液的第1酸區(qū)峰、賴氨酸變異體之間的峰和賴氨酸變異體2峰準確度回收率均在80%～115%范圍內(nèi)，第2酸區(qū)峰、主峰和賴氨酸變異體1峰準確度回收率在均85%～110%范圍內(nèi)，結果見表5—10。

2.7

耐用性

在不同pH的流動相、B相NaCl濃度、流速與柱溫、色譜柱批號條件下結果一致性較好，酸區(qū)面積百分比RSD均小于4.0%，賴氨酸變異體總量面積百分比RSD均小于4.0%，賴氨酸變異體1和2之間面積百分比RSD均小于6.0%，見表11—14。

2.8

方法的應用

武漢公司抗體研究室生產(chǎn)的阿達木單抗注射液原液和阿達木單抗注射液檢測結果見表15。

3

阿達木單抗由美國艾伯維公司原研，商品名修美樂，自2002年獲FDA批準、2003 年獲歐洲藥品管理局批準后，市場表現(xiàn)卓越 。阿達木單抗原研產(chǎn)品專利已分別于2016年和2018年在美國和歐盟到期，截至2024年11月，clinicaltrials.gov上登記的阿達木單抗生物類似藥相關試驗達43項，目前歐美已批準10款，國內(nèi)也有8款獲批。

電荷變異體的產(chǎn)生主要由翻譯后修飾引起，這些修飾會改變抗體的電荷特性和物理化學性質。通過電荷變異體檢測，可以識別潛在的質量差異并優(yōu)化生產(chǎn)工藝，確保不同批次產(chǎn)品的一致性和穩(wěn)定性。

在生物類似藥的開發(fā)中，電荷變異體的水平是評價其與原研藥一致性的關鍵質量屬性，并有助于提升生物類似藥與原研藥之間的相似性評價。

本研究建立并驗證了阿達木單抗電荷變異體的CEX分析方法。驗證結果表明，空白溶劑色譜圖中，除溶劑峰外，未見明顯色譜峰；阿達木單抗注射液色譜圖各組分色譜峰分離度良好，且空白溶劑峰對各組分峰均不干擾，表明該方法專屬性良好。對阿達木單抗參比品重復檢測6次，各組分RSD均＜2%；不同的實驗員使用不同的設備對阿達木單抗參比品重復檢測6次，各組分RSD均＜2%，表明該方法重復性和中間精密度良好。賴氨酸變異體之間的峰的定量限為100 μg/mL（信噪比＞10），賴氨酸變異體之間的峰的檢測限為30 μg/mL（信噪比＞3），表明該方法檢測限和定量限濃度較低，可滿足供試品檢測要求。在第1酸區(qū)峰2.0%~10.0%、第2酸區(qū)峰8.0%~32.0%、主峰52.0%~78.0%、賴氨酸變異體1峰16.0%~24.0%、賴氨酸變異體之間的峰1.0%~5.0%、賴氨酸變異體2峰3.0%~7.0%范圍內(nèi)檢測各組分線性良好，R2均＞0.99；第1酸區(qū)峰、賴氨酸變異體之間的峰和賴氨酸變異體2峰準確度回收率均在80%～115%范圍內(nèi)，第2酸區(qū)峰、主峰和賴氨酸變異體1峰準確度回收率均在85%～110%范圍內(nèi)，符合中國藥典2020年版分析方法驗證指導原則（9101）的要求。耐用性試驗證明，該方法對流動相pH、NaCl濃度、流速和柱溫、色譜柱批次的微小變化具有較強耐受性，適用于不同實驗室間的應用。方法的初步應用結果表明，該方法適用于武漢公司抗體研究室生產(chǎn)的阿達木單抗注射液原液和成品的檢測。

本研究建立的CEX方法不僅適用于阿達木單抗，還為其他治療性單抗的電荷變異體分析打開思路。未來可進一步探索電荷分布與藥物體內(nèi)藥效、免疫原性的相關性，為生物類似藥的臨床評價提供更全面的質量依據(jù)。

作者

周蓉1 鄧小杰2 何亮1 羅敏1 桂芳2 申璦琳1 潘俊杰1 袁媛1 王嘉瑞1 孫玉珠1 李青卓2 唐杰2 潘勇兵2 施金榮1

1武漢生物制品研究所有限責任公司質量控制室，武漢 430207；2武漢生物制品研究所有限責任公司抗體研究室，武漢 430207

通信作者：施金榮，

Email：shijinrong@sinopharm.com

引用本文：周蓉, 鄧小杰, 何亮, 等. 阿達木單抗電荷變異體檢測的陽離子交換色譜法建立及驗證[J]. 國際生物制品學雜志, 2025, 48(6): 412-419.

DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20250516-00034

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