赭曲霉毒素A（OTA）是由黑曲霉、赭曲霉或石炭曲霉等真菌產(chǎn)生的次生代謝物，已被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為2B類致癌物。飲食攝入是人們接觸OTA的主要途徑。生物解毒被認(rèn)為是減少OTA污染的新策略。

近年來(lái)眾多研究報(bào)道了酵母、芽孢桿菌和無(wú)毒真菌等能夠通過(guò)細(xì)胞吸附或產(chǎn)酶降解OTA，而酶法降解OTA因其高效、便捷和不消耗食品本身營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而被廣泛應(yīng)用。然而大部分天然酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，其結(jié)構(gòu)并不穩(wěn)定，通過(guò)將酶固定則可以解決這一問(wèn)題。各種類型的材料，包括天然或合成聚合物和無(wú)機(jī)材料，以不同的方式用作酶固定的支持物。眾多載體中，金屬有機(jī)骨架（MOF）因孔徑均勻、比表面積大、生物相容性良好的優(yōu)點(diǎn)備受關(guān)注。MOF是由金屬離子和有機(jī)配體（連接體）通過(guò)配位鍵連接而成的納米晶體材料，在氣體儲(chǔ)存、藥物輸送、催化、傳感等領(lǐng)域都有廣闊的應(yīng)用前景。Zn-MOF作為載體，可通過(guò)一步原位固定法實(shí)現(xiàn)酶負(fù)載，不僅能夠節(jié)約合成時(shí)間，而且該方法條件溫和、固定后的酶穩(wěn)定性較好，因此可用于OTA降解酶的固定。

源自Aspergillus niger的脂肪酶A（ANL），可以通過(guò)水解破壞OTA的酰胺鍵將其轉(zhuǎn)化為赭曲霉毒素

和苯丙氨酸。為提高ANL對(duì)OTA的降解效率， 西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院的郇佳欣、黃燕萍、袁春龍*等 研究采用原位一步合成法將ANL負(fù)載到Zn-MOF上，制備Zn-MOF固定化脂肪酶（ANL

Zn-MOF），通過(guò)優(yōu)化合成參數(shù)和系列表征技術(shù)探究ANL

Zn-MOF的物理化學(xué)特性，同時(shí)以O(shè)TA降解率為評(píng)價(jià)指標(biāo)系統(tǒng)探究ANL

Zn-MOF對(duì)OTA的降解性能及其影響因素，明確ANL

Zn-MOF循環(huán)使用的穩(wěn)定性，以期為酶法去除食品及飼料中的OTA提供新思路。

1 ANL

Zn-MOF的表征結(jié)果

為了明確ANL負(fù)載后Zn-MOF的理化性質(zhì)，采用多種表征手段系統(tǒng)探究了Zn-MOF和ANL

Zn-MOF的形貌、晶體結(jié)構(gòu)、表面官能團(tuán)和熱穩(wěn)定性。由圖1a可知，Zn-MOF為板狀且大小均勻。與Zn-MOF相比，由0.6 mg/mL ANL制備的ANL

Zn-MOF形狀和大小略有變化，但仍為板狀（圖1b）。隨著合成體系中ANL質(zhì)量濃度的升高，ANL@Zn-MOF仍然保持板狀（圖1c、d），說(shuō)明在本實(shí)驗(yàn)條件下，Zn-MOF合成體系中ANL的添加量對(duì)Zn-MOF的形態(tài)基本無(wú)顯著影響。

如圖2a所示，Zn-MOF中的有機(jī)芳香配體在3 340～3 100、1 600～1 550、1 500～1 430 cm-1和900～700 cm-1處有明顯的特征峰，其中3 319 cm-1處的峰是由于N—H的伸縮振動(dòng)。1 558 cm-1和1 398 cm-1處的峰對(duì)應(yīng)羧基的不對(duì)稱和對(duì)稱拉伸。1 431 cm-1處的小峰對(duì)應(yīng)與Zn-MOF鍵合的去質(zhì)子化羧酸離子；ANL@Zn-MOF的紅外光譜不僅存在Zn-MOF的特征峰，而且由于ANL的負(fù)載導(dǎo)致ANL@Zn-MOF在3 319 cm-1處的特征吸收峰明顯增強(qiáng)，說(shuō)明ANL@Zn-MOF成功合成。此外，與Zn-MOF相比，ANL@Zn-MOF并未出現(xiàn)新的吸收峰，表明ANL是以物理吸附的方式固定于MOF之中。物理吸附的實(shí)現(xiàn)可能是因?yàn)锳NL@Zn-MOF具有較大的比表面積，為酶的物理固定提供了充足的吸附位點(diǎn)，且其表面存在羧基基團(tuán)，這些羧基具有較強(qiáng)的極性，能夠與酶分子通過(guò)氫鍵和靜電相互作用，從而實(shí)現(xiàn)了ANL在Zn-MOF上的有效固定。通過(guò)對(duì)游離ANL和ANL@Zn-MOF的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征吸收峰分析可知，ANL在1 658 cm-1處的峰值是脂肪酶的α-螺旋結(jié)構(gòu)導(dǎo)致酰胺I鍵的C＝O拉伸振動(dòng)，而ANL@Zn-MOF在1 658 cm-1處的峰值移至1 620 cm-1處，這可能是Zn-MOF多孔結(jié)構(gòu)對(duì)ANL的束縛導(dǎo)致ANL的

-螺旋結(jié)構(gòu)變?yōu)榫奂?，?00～700 cm -1 酰胺帶的峰強(qiáng)度增加進(jìn)一步證明ANL成功固定于Zn-MOF中。

本實(shí)驗(yàn)采用XRD分析ANL

Zn-MOF和Zn-MOF的晶體特性，結(jié)果如圖2b所示。Zn-MOF在10.7°、19.42°、24.06°、26.14°處有顯著的特征衍射峰。同樣，ANL

Zn-MOF也顯示了Zn-MOF的特征衍射峰，說(shuō)明Zn-MOF負(fù)載ANL前后的晶體結(jié)構(gòu)未發(fā)生變化，由于脂肪酶負(fù)載到Zn-MOF中，部分衍射峰發(fā)生偏移。

為了明確負(fù)載前后Zn-MOF的熱穩(wěn)定性，分別測(cè)試了ANL

Zn-MOF、Zn-MOF和ANL在30～700 ℃范圍內(nèi)的質(zhì)量損失，結(jié)果如圖2c、d所示。對(duì)于Zn-MOF而言，在100～160 ℃范圍內(nèi)觀察到輕微（近3.38%）的質(zhì)量損失，主要是Zn-MOF粉末中存在的游離水蒸發(fā)所致；在189～224 ℃范圍內(nèi)觀察到2.15%的質(zhì)量損失，這是由于與MOF結(jié)構(gòu)緊密結(jié)合的水分蒸發(fā)；由于Zn-MOF的結(jié)構(gòu)分解，在380～550 ℃范圍內(nèi)觀察到較大的質(zhì)量損失（近38.71%）。在ANL

Zn-MOF中同樣發(fā)現(xiàn)，由于MOF和脂肪酶中水分子的損失，在110～180 ℃有相對(duì)較大的質(zhì)量損失（近10.39%） ；由于脂肪酶的湮滅，ANL

Zn-MOF的質(zhì)量損失始于270 ℃左右，一直持續(xù)到550 ℃ 。通過(guò)差熱分析可知，在120～550 ℃范圍內(nèi)，ANL

Zn-MOF的質(zhì)量損失率高于Zn-MOF，這種較大的質(zhì)量損失是因?yàn)閆n-MOF中存在ANL，尤其在380 ℃時(shí)ANL

Zn-MOF的質(zhì)量損失比Zn-MOF高約14.4%，這進(jìn)一步證實(shí)了ANL成功固定在Zn-MOF中。

2 Zn-MOF對(duì)ANL固定的條件優(yōu)化

為了提高Zn-MOF對(duì)ANL負(fù)載量，本實(shí)驗(yàn)對(duì)ANL

Zn-MOF合成時(shí)酶的添加量、合成時(shí)間及攪拌速率進(jìn)行了優(yōu)化，以O(shè)TA降解率確定ANL

Zn-MOF制備的工藝參數(shù)。如圖3a所示，當(dāng)ANL質(zhì)量濃度為0.2～1.0 mg/mL時(shí)，Zn-MOF對(duì)ANL的固定率隨酶質(zhì)量濃度的升高呈先降低后升高的趨勢(shì)，但當(dāng)體系中ANL的質(zhì)量濃度高于1.0 mg/mL時(shí)，Zn-MOF對(duì)ANL的固定率趨于平穩(wěn)。當(dāng)ANL質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，ANL

Zn-MOF對(duì)OTA的降解率最高，達(dá)到了69.9%。因此，確定在ANL

Zn-MOF制備過(guò)程中ANL的質(zhì)量濃度為1 mg/mL。反應(yīng)時(shí)間不僅影響ANL與Zn-MOF的相互作用，也對(duì)Zn-MOF晶體形成至關(guān)重要。如圖3b所示，Zn-MOF對(duì)ANL的固定率和ANL

Zn-MOF對(duì)OTA的降解率隨著合成時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。在合成時(shí)間為2 h時(shí)，ANL

Zn-MOF對(duì)OTA的降解率達(dá)到最高（71.8%），因此確定ANL

Zn-MOF的最佳合成時(shí)間為2 h。攪拌速率影響ANL

Zn-MOF合成體系中各物質(zhì)之間的相互作用。由圖3c可知，在400 r/min的攪拌條件下ANL的固定率最高，達(dá)到23.7%，且該條件下制備的ANL

Zn-MOF對(duì)OTA的降解率較高（73.0%）。因此，制備ANL

Zn-MOF的最佳條件為ANL質(zhì)量濃度1.0 mg/mL、合成時(shí)間2 h、攪拌速率400 r/min，在該條件下酶載量可達(dá)155 mg/g。

3 ANL

Zn-MOF對(duì)OTA的降解分析

3.1 體系中ANL濃度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)OTA降解率的影響

為了明確ANL

Zn-MOF中ANL是否具有OTA降解能力，本實(shí)驗(yàn)以游離的ANL為對(duì)照，以ANL質(zhì)量濃度和反應(yīng)時(shí)間為變量，對(duì)比了ANL和ANL

Zn-MOF對(duì)OTA的降解效果。由圖4可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，二者對(duì)OTA的降解率逐漸升高，說(shuō)明Zn-MOF本身對(duì)ANL活性無(wú)影響；但在相同的ANL質(zhì)量濃度條件下，ANL

Zn-MOF對(duì)OTA的降解率比ANL高。體系中添加的ANL質(zhì)量濃度越大，OTA的降解率越高。對(duì)于游離的ANL而言，當(dāng)其質(zhì)量濃度為20、30 ng/mL時(shí)，經(jīng)過(guò)24 h后其對(duì)OTA的降解率高達(dá)100%，而ANL

Zn-MOF中的ANL質(zhì)量濃度為10 ng/mL即可在24 h內(nèi)完全降解OTA，這表明經(jīng)Zn-MOF固定后顯著提高了ANL對(duì)OTA的降解能力，且在相同酶濃度下，ANL

Zn-MOF對(duì)OTA的降解能力更強(qiáng)，ANL

Zn-MOF（其中ANL質(zhì)量濃度為20 ng/mL）能在8 h內(nèi)完全降解OTA，比游離ANL完全降解OTA的時(shí)間縮短了66.7%，這可能是因?yàn)橛坞x的酶分子在溶液中相比于固定酶更容易發(fā)生聚集現(xiàn)象，導(dǎo)致活性位點(diǎn)被遮蔽。而固定化可以將酶分子分散并固定在載體上，避免酶分子之間的相互聚集，保持了酶的活性。同時(shí)Zn-MOF可以為ANL提供一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的微環(huán)境，保護(hù)ANL的活性結(jié)構(gòu)，防止其在反應(yīng)過(guò)程中發(fā)生變性或失活。這使得ANL能夠保持較高的活性，持續(xù)有效地對(duì)OTA進(jìn)行降解。

3.2 不同條件下ANL

Zn-MOF對(duì)OTA的降解情況

3.2.1 pH值

體系pH值的變化可以引起酶構(gòu)象變化或底物電荷特性等性質(zhì)的改變，對(duì)酶活性影響較大。由圖5a可知，pH值對(duì)ANL

Zn-MOF和ANL的OTA降解能力具有顯著影響，隨著體系pH值的升高，二者的OTA降解率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，且當(dāng)pH 7.0時(shí)OTA的降解率最高。而在偏酸性和堿性條件下，ANL

Zn-MOF和ANL的活性均降低。這可能是在較低或較高pH值條件下，由于ANL的變性或其構(gòu)象改變削弱了活性位點(diǎn)與OTA的相互作用。此外，在酸性環(huán)境中ANL

Zn-MOF的OTA降解率略低于ANL，在堿性環(huán)境中ANL

Zn-MOF對(duì)OTA的降解率比ANL高出20%以上。這可能是由于NH 2 -BDC的羧基帶負(fù)電荷，降低了ANL吸附位點(diǎn)周圍的pH值，因此在反應(yīng)體系pH值較高的情況下，ANL

Zn-MOF對(duì)OTA的降解率仍能保持較高的水平。這種將酶固定后導(dǎo)致其pH值最適區(qū)域向酸性或堿性方向轉(zhuǎn)變的情況在其他酶中也觀察到。

3.2.2 溫度

溫度通過(guò)增加自由能水平從而降低或升高酶促反應(yīng)的活化能，進(jìn)而改變酶-底物復(fù)合物中的相互作用。由圖5b可知，隨著溫度由25 ℃升高至75 ℃，ANL

Zn-MOF和ANL對(duì)OTA降解率均呈現(xiàn)先升高后降低，且ANL

Zn-MOF的OTA降解率均高于ANL，尤其是在45 ℃條件下ANL

Zn-MOF對(duì)OTA的降解率高達(dá)73%。與ANL相比，ANL

Zn-MOF具有較好的熱穩(wěn)定性，在體系溫度為65 ℃及以上時(shí)，ANL

Zn-MOF仍能夠降解體系中的OTA，降解率高于30%。這可能是因?yàn)锳NL負(fù)載在Zn-MOF后其三維構(gòu)象更加穩(wěn)定，從而防止其催化中心的變性。

3.2.3 體系離子強(qiáng)度

在酶促反應(yīng)的過(guò)程中，底物或酶分子中具有催化作用的氨基酸發(fā)生電離，而在離子強(qiáng)度不同的情況下，酶分子的氨基酸殘基可能會(huì)發(fā)生質(zhì)子化或去質(zhì)子化反應(yīng)，并影響底物的結(jié)合和轉(zhuǎn)化。而且考慮到ANL特殊的作用機(jī)制，反應(yīng)體系的離子強(qiáng)度會(huì)影響ANL活性中心的開(kāi)放和關(guān)閉程度，因此本實(shí)驗(yàn)探究了體系中離子強(qiáng)度對(duì)ANL

Zn-MOF的OTA降解效果的影響，結(jié)果如圖5c所示。隨著磷酸鹽緩沖液濃度的增加，ANL

Zn-MOF和ANL的OTA降解率均呈先升高后降低的趨勢(shì)，這是因?yàn)楦唠x子強(qiáng)度不利于ANL活性中心的暴露，從而影響ANL

Zn-MOF和ANL對(duì)OTA的降解能力。值得注意的是，在離子濃度高達(dá)24 mmol/L的條件下，ANL

Zn-MOF的OTA降解率比ANL高出20%左右。且ANL

Zn-MOF的OTA降解率始終高于ANL；當(dāng)磷酸鹽緩沖液濃度為12 mmol/L時(shí)，ANL

Zn-MOF的OTA降解率達(dá)到最高值，為74.8%，ANL的OTA降解率為40.0%。

3.2.4 反應(yīng)體系體積

由圖5d可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，2 種反應(yīng)體系（5、500 mL）下ANL

Zn-MOF對(duì)OTA的降解率均逐漸升高。在相同的時(shí)間條件下，5 mL反應(yīng)體系的降解率始終高于500 mL反應(yīng)體系。這表明反應(yīng)體系體積對(duì)ANL

Zn-MOF降解OTA的效果有影響。在5 mL的反應(yīng)體系中，ANL

Zn-MOF對(duì)OTA的降解率更高，可能是因?yàn)樵谳^小的體系中底物和催化劑的分布相對(duì)更加均勻，分子間的有效碰撞幾率更高，從而使得降解反應(yīng)能夠更快速有效地進(jìn)行。而在較大的反應(yīng)體系（500 mL）中，底物和催化劑的擴(kuò)散相對(duì)較慢，可能導(dǎo)致局部濃度不均勻，影響了反應(yīng)的進(jìn)行速度和最終的降解效率。盡管如此，在較大的反應(yīng)體系下ANL

Zn-MOF仍能在12 h內(nèi)降解69.3%的OTA。同時(shí)，較小體系中OTA的降解率更高也可能是因?yàn)槭芡饨绺蓴_因素相對(duì)較少，有利于維持反應(yīng)的高效進(jìn)行。

3.2.5 ANL@Zn-MOF的循環(huán)使用性

固定化酶可以循環(huán)使用，且在循環(huán)使用的過(guò)程中能保持酶原有的催化性能，明確固定化酶的循環(huán)特性對(duì)其工業(yè)應(yīng)用至關(guān)重要。如圖5e所示，ANL

Zn-MOF對(duì)OTA的降解率在使用2 次后緩慢下降，在使用5 次后ANL

Zn-MOF仍能保留78%的相對(duì)活性。ANL

Zn-MOF的活性降低可能是由于ANL的分離和失活，以及離心和洗滌過(guò)程中固定化酶的損失。對(duì)重復(fù)使用5 次后ANL

Zn-MOF的形貌觀察可知，ANL

Zn-MOF依然保持原來(lái)的板狀（圖5f），說(shuō)明其具有較好的穩(wěn)定性，能夠根據(jù)需求循環(huán)使用。

結(jié)論

為了解決ANL在降解OTA時(shí)存在的穩(wěn)定性差和難以循環(huán)利用的難題，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)一步原位固定法制備了ANL

Zn-MOF，其最優(yōu)制備條件為酶質(zhì)量濃度1 mg/mL、合成時(shí)間2 h、攪拌速率400 r/min，同時(shí)考察了不同pH值、溫度、離子強(qiáng)度和反應(yīng)體系體積條件下ANL

Zn-MOF對(duì)OTA的降解情況。結(jié)果表明，經(jīng)Zn-MOF固定拓寬了ANL的溫度使用范圍，增強(qiáng)了其耐堿性，在pH＞7、溫度高于65 ℃和離子濃度高達(dá)24 mmol/L的條件下，ANL

Zn-MOF的OTA降解率比ANL高出20%左右，在較大的反應(yīng)體系下ANL

Zn-MOF仍能在12 h內(nèi)降解69.3%的OTA。同時(shí)ANL

Zn-MOF具有較好的穩(wěn)定性，循環(huán)使用5 次仍能保持其78%的OTA降解能力。本研究可為后續(xù)利用ANL

Zn-MOF降解食品體系中的OTA奠定基礎(chǔ)。

本文《Zn-金屬有機(jī)骨架固定脂肪酶及其對(duì)赭曲霉毒素A的高效降解》來(lái)源于《食品科學(xué)》2025年46卷第16期175-182頁(yè)，作者：郇佳欣，黃燕萍，牛彥哲，宋宏，劉滿順，袁春龍*。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20241227-237。點(diǎn)擊下方閱讀原文即可查看文章相關(guān)信息。

實(shí)習(xí)編輯：劉芯；責(zé)任編輯：張睿梅。點(diǎn)擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來(lái)源于文章原文及攝圖網(wǎng)