如果說(shuō)現(xiàn)有的CRISPR單細(xì)胞篩選技術(shù)是“管中窺豹”，那么研究人員真正需要的，是一個(gè)能夠同時(shí)看清基因表達(dá)、染色質(zhì)狀態(tài)和轉(zhuǎn)錄動(dòng)態(tài)的多維窗口。單一模態(tài)的讀出固然有價(jià)值，但細(xì)胞響應(yīng)擾動(dòng)的過(guò)程本質(zhì)上是多層次的：轉(zhuǎn)錄因子活性變化、染色質(zhì)重塑、基因表達(dá)程序的切換往往同步發(fā)生，割裂地分析任何一個(gè)維度都難以還原全貌。

2026年4月15日，The Rockefeller University的曹俊越與周偉團(tuán)隊(duì)（博士生許子涵為本文第一作者兼共同通訊作者）在Nature發(fā)表了文章Mapping convergent regulators of melanoma drug resistance by PerturbFate，推出了PerturbFate——一個(gè)將CRISPRi擾動(dòng)與單細(xì)胞多組學(xué)檢測(cè)深度整合的高通量篩選平臺(tái)，首次在單細(xì)胞分辨率下同時(shí)捕獲染色質(zhì)可及性、新生RNA和穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)錄組，并以黑色素瘤耐藥模型為示范，展示了該平臺(tái)解析復(fù)雜細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變的強(qiáng)大能力。

近年來(lái)，以Perturb-seq為代表的CRISPR單細(xì)胞篩選技術(shù)深刻改變了基因功能研究的范式。然而，這類方法的核心局限始終存在：它們通常只能在一次實(shí)驗(yàn)中讀取一種分子層次的信息，要么是基因表達(dá)，要么是染色質(zhì)可及性，魚(yú)與熊掌難以兼得。

這一限制在研究細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變時(shí)尤為棘手。細(xì)胞狀態(tài)的維持與切換，本質(zhì)上是轉(zhuǎn)錄因子、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)程序的協(xié)同運(yùn)作——任何單一維度的快照都只是冰山一角。與此同時(shí)，現(xiàn)有平臺(tái)的通量與成本也制約著篩選規(guī)模，難以在大規(guī)?；蚣祥_(kāi)展系統(tǒng)性探索。

研究發(fā)現(xiàn)

一個(gè)細(xì)胞，三層信息，成本低于一分錢

PerturbFate的核心創(chuàng)新在于將代謝標(biāo)記新生RNA（5-EU標(biāo)記，捕獲剛被轉(zhuǎn)錄出的RNA，反映實(shí)時(shí)轉(zhuǎn)錄活動(dòng)）、染色質(zhì)可及性檢測(cè)（ATAC-seq，揭示基因組哪些區(qū)域處于“開(kāi)放”狀態(tài)）和穩(wěn)態(tài)基因表達(dá)整合進(jìn)同一套單細(xì)胞流程。依托單細(xì)胞組合索引（sci）技術(shù)，PerturbFate無(wú)需微流控設(shè)備，可在普通實(shí)驗(yàn)室條件下實(shí)現(xiàn)大規(guī)模并行檢測(cè)，單細(xì)胞成本低于$0.01。研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)一系列嚴(yán)格驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證明了各模態(tài)的檢測(cè)質(zhì)量：物種區(qū)分實(shí)驗(yàn)中單細(xì)胞純度超過(guò)99%，新生RNA標(biāo)記背景噪音低于0.4%，染色質(zhì)信號(hào)在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)處呈現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)富集模式。此外，專門優(yōu)化的雙sgRNA載體設(shè)計(jì)顯著提升了CRISPRi的敲降效率，使大規(guī)模篩選結(jié)果更為穩(wěn)健可靠。

31萬(wàn)細(xì)胞，143個(gè)基因，一張完整的耐藥調(diào)控地圖

為展示PerturbFate的實(shí)際應(yīng)用能力，研究團(tuán)隊(duì)選取黑色素瘤BRAFV600E突變細(xì)胞對(duì)維羅非尼（Vemurafenib，一種臨床常用的BRAF抑制劑）耐藥這一經(jīng)典問(wèn)題作為示范場(chǎng)景。在無(wú)藥和藥物處理兩種條件下，團(tuán)隊(duì)對(duì)143個(gè)候選基因進(jìn)行了系統(tǒng)擾動(dòng)，最終分析超過(guò)31萬(wàn)個(gè)單細(xì)胞。通過(guò)整合RNA與染色質(zhì)數(shù)據(jù)，研究團(tuán)隊(duì)重建了黑色素瘤細(xì)胞的連續(xù)表型軌跡——從分化的黑色素細(xì)胞態(tài)，經(jīng)由神經(jīng)嵴樣中間態(tài)，到去分化的未分化耐藥態(tài)。分析發(fā)現(xiàn)，52個(gè)擾動(dòng)可顯著驅(qū)動(dòng)細(xì)胞向耐藥狀態(tài)遷移，且這一效應(yīng)與獨(dú)立bulk篩選中測(cè)定的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)高度一致（Pearson r = 0.594），充分說(shuō)明PerturbFate的多組學(xué)讀出能夠忠實(shí)反映真實(shí)的細(xì)胞功能變化。

多基因擾動(dòng)匯聚于共同轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控樞紐

進(jìn)一步的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析揭示，不同基因的缺失盡管各有其機(jī)制，卻共同激活了一個(gè)由FOSL1、KLF5、RREB1、SMAD3等轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)成的高度協(xié)作調(diào)控樞紐。在所有耐藥相關(guān)擾動(dòng)中，這些轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控活性表現(xiàn)出顯著的正相關(guān)——這意味著，不同遺傳背景下的耐藥并非各自為政，而是匯聚于同一套轉(zhuǎn)錄程序之上。正如研究團(tuán)隊(duì)所言：“我們開(kāi)始將耐藥不再看作一份不斷增長(zhǎng)的‘靶點(diǎn)清單’，而是看作圍繞共同調(diào)控邏輯構(gòu)建的結(jié)構(gòu)性問(wèn)題——這或許更具可干預(yù)性?！苯柚律鶵NA提供的實(shí)時(shí)轉(zhuǎn)錄信息，團(tuán)隊(duì)還進(jìn)一步鑒定出Hippo/YAP信號(hào)通路是這一匯聚調(diào)控樞紐的核心上游驅(qū)動(dòng)力，YAP依賴性基因程序在去分化耐藥狀態(tài)中普遍激活。

聯(lián)合靶向驗(yàn)證：組合阻斷比單點(diǎn)打擊更有效

鑒定出匯聚調(diào)控樞紐之后，研究團(tuán)隊(duì)在維羅非尼處理?xiàng)l件下檢驗(yàn)了同時(shí)干預(yù)多個(gè)節(jié)點(diǎn)的效果。結(jié)果顯示，單獨(dú)抑制SMAD3或單獨(dú)敲降RREB1對(duì)耐藥的影響均十分有限；然而，將兩者聯(lián)合使用，則顯著削弱了耐藥細(xì)胞群體的整體生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，進(jìn)一步加入KLF5抑制后效果更為突出。這一結(jié)果直接驗(yàn)證了匯聚調(diào)控樞紐中多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子相互協(xié)作、功能互補(bǔ)的特性——單點(diǎn)干預(yù)難以突破，組合阻斷才能有效瓦解耐藥程序，為未來(lái)聯(lián)合用藥策略的設(shè)計(jì)提供了具體的分子邏輯。

Mediator復(fù)合體與匯聚效應(yīng)因子VEGFC

研究團(tuán)隊(duì)還重點(diǎn)剖析了Mediator復(fù)合體各模塊擾動(dòng)對(duì)細(xì)胞狀態(tài)的差異性影響。Mediator復(fù)合體是連接轉(zhuǎn)錄因子與RNA聚合酶的核心轉(zhuǎn)錄共激活子，激酶模塊（以MED12為代表）的敲低持續(xù)激活炎癥基因程序，并通過(guò)解除對(duì)Core Mediator的抑制促進(jìn)YAP驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄，從而推動(dòng)細(xì)胞去分化——其中MED12敲低在有藥無(wú)藥條件下均產(chǎn)生最強(qiáng)的耐藥效應(yīng)，且這一效應(yīng)獨(dú)立于激酶模塊其他組分之外。更引人關(guān)注的是，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C（VEGFC）被鑒定為跨越不同Mediator擾動(dòng)的共同下游效應(yīng)因子，功能驗(yàn)證證實(shí)VEGFC敲低可顯著削弱多個(gè)耐藥擾動(dòng)的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，揭示其作為匯聚治療靶點(diǎn)的潛力。

意義與展望

PerturbFate將高通量CRISPR篩選的信息維度從“單聲道”提升到“多聲道”，同時(shí)保持極低的實(shí)驗(yàn)門檻與成本。這項(xiàng)研究更重要的概念性貢獻(xiàn)在于：它證明了不同遺傳擾動(dòng)可以匯聚于同一套調(diào)控邏輯——這一發(fā)現(xiàn)改變了研究者理解疾病耐藥機(jī)制的視角，也為尋找可干預(yù)的共同靶點(diǎn)提供了框架。

從更廣泛的視角看，PerturbFate同樣適用于組織再生、免疫激活、衰老等多種需要理解細(xì)胞命運(yùn)決定機(jī)制的生物學(xué)場(chǎng)景——凡是涉及瞬時(shí)、異質(zhì)或匯聚性細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變的問(wèn)題，都是PerturbFate的用武之地。

曹俊越實(shí)驗(yàn)室（Laboratory of Single Cell Genomics and Population Dynamics）隸屬于The Rockefeller University，研究方向聚焦于單細(xì)胞多組學(xué)技術(shù)開(kāi)發(fā)，以及這些技術(shù)在衰老和神經(jīng)科學(xué)中的應(yīng)用。在技術(shù)創(chuàng)新方面，實(shí)驗(yàn)室近年來(lái)持續(xù)推出新一代單細(xì)胞平臺(tái)：2023年在Nature Biotechnology發(fā)表PerturbSci-kinetics，將CRISPR篩選與代謝標(biāo)記新生RNA相結(jié)合，在單細(xì)胞水平系統(tǒng)解析了基因擾動(dòng)對(duì)轉(zhuǎn)錄動(dòng)態(tài)（涵蓋RNA合成、加工與降解）的影響；2024年開(kāi)發(fā)了無(wú)需光學(xué)成像設(shè)備的空間基因組學(xué)平臺(tái)IRISeq；2025年在Cell Genomics發(fā)表EnrichSci，一種基于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的靶向細(xì)胞富集測(cè)序平臺(tái)，可對(duì)特定稀有細(xì)胞類型（如腦內(nèi)少突膠質(zhì)細(xì)胞亞型）進(jìn)行高深度單核轉(zhuǎn)錄組分析。在衰老圖譜方面，實(shí)驗(yàn)室于2023年在Nature Genetics完成了人類和小鼠腦衰老及阿爾茨海默病的系統(tǒng)性單細(xì)胞圖譜研究；2024年在Science繪制了涵蓋14個(gè)器官、超過(guò)2100萬(wàn)個(gè)單細(xì)胞的哺乳動(dòng)物衰老轉(zhuǎn)錄組圖譜；2025年在Cell Reports揭示了熱量限制對(duì)哺乳動(dòng)物腦衰老的時(shí)空調(diào)控；2026年2月再次在Science發(fā)表了涵蓋21個(gè)組織、約700萬(wàn)個(gè)單細(xì)胞的全身染色質(zhì)可及性衰老圖譜，系統(tǒng)闡明了衰老過(guò)程中細(xì)胞動(dòng)態(tài)與表觀基因組重塑的規(guī)律，相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)已公開(kāi)發(fā)布于epiage.net。

附曹俊越團(tuán)隊(duì)近年來(lái)部分工作：

（2019）

（2020）

（2020）

（2023）

（2023）

（2024）

（2026）

https://www.nature.com/articles/s41586-026-10367-0

制版人： 十一

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（*排名不分先后）

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